| 查看: 9841 | 回复: 24 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[求助]
求助！新人，融合PCR一直融不上！！！ 已有6人参与
|
|||
|
我做的是三片段融合，大小分别是1039、720、980，融合片段大小为2739bp，分别先p出来，退货、、退火温度都是53度，然后进行融合，条件是 50μl 体系： 10xPCR buffer 5μ dNTP 5μ 上游正向引物AF1 2μ 下游反向引物AR2 2μ 同源臂1（1039）（7.7ng/μl） 各加50ng左右作为模板 同源臂2（720）（24.6ng/μl） 同源臂3（980）（11.8ng/μl） ddH2O2 补至50μ Taq酶 0.25μ 预变性 94 ℃ 5min 变性 94 ℃ 30s 复性 53 ℃ 30s 30个循环 延伸 72 ℃ 3min 延伸 72 ℃ 10min 保存 4℃ 一直就融不上，后来降低退火温度升高退火温度都融不上，也设了梯度了，好奇怪三个片段的温度都是53度为什么最后融合53度就是融不上呢？？难道是因为Taq酶加A尾了吗？但是我师兄做的是两片段融合就用的Taq酶啊，就融上了！为毛线！！！！求指点！！！！真是做了一学期了快！ 下面上电泳图！ 一直都是引物二聚体很亮，目的条带啥也没有！！！！  除了marker什么也没p出来的电泳图.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有283人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- Real-time PCR 的数据如果跟其他数据不吻合怎么办？
已经有4人回复
- 重叠PCR比想象中的诡异p几十轮了始终没有拿到大片段
已经有17人回复
- 融合PCR请帮忙看看图片吧
已经有6人回复
- 融合PCR详细步骤
已经有8人回复
- 融合PCR最后一步做不出来，求救！！！
已经有23人回复
- 无模板pcr合成短片段 一直失败
已经有44人回复
- PCR扩增融合基因
已经有21人回复
- PCR体系放大后无目的片段
已经有15人回复
- 做过跨膜蛋白原核表达的战友过来看看哦
已经有18人回复
- 重叠延伸PCR引物合成求助
已经有15人回复
- 关于融合PCR的问题
已经有14人回复
- PCR ， 双酶切，连接问题
已经有17人回复
- 融合pcr怎么总是不成功啊
已经有9人回复
- 【求助/交流】pGEM-T Easy载体 T-A 连接 为啥没连入PCR产物的 菌斑是蓝斑
已经有23人回复
- 【求助/交流】PCR产物测序总是不对
已经有13人回复
- 【求助/交流】请教个关于inverse PCR的问题
已经有21人回复
- 【求助/交流】关于荧光定量PCR中cdna合成的问题
已经有12人回复
- 【求助/交流】PCR 聚合酶链反应是用来干嘛的
已经有20人回复
- 【求助/交流】从RNA到cDNA合成再到克隆PCR的实验技巧和操作细节问题若干，寻求解答
已经有12人回复
- 【求助/交流】PCR后的产物电泳电压多少合适？
已经有10人回复
- 【分享】realtime pcr 个人经验分享
已经有41人回复
lingsheshidu
金虫 (小有名气)
- 应助: 16 (小学生)
- 金币: 771.5
- 散金: 794
- 红花: 2
- 帖子: 128
- 在线: 160.7小时
- 虫号: 2405268
- 注册: 2013-04-07
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2014-06-05 10:10:09
gyesang: 回帖置顶 2014-06-05 10:10:13
571900696: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-06-05 10:28:28
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2014-06-05 10:10:09
gyesang: 回帖置顶 2014-06-05 10:10:13
571900696: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-06-05 10:28:28
|
1. 融合PCR最好不要用Taq酶，既然楼主都知道末端加尾的问题。 2. 直接用普通PCR程序恐怕难以扩增出目的条带。不知道你同源臂相互匹配的片段有多长？建议：（1）适当延长退火时间，如果匹配片段比较长，提高退火温度。（2）减少循环数，比如10-15个循环，然后取2-5uL直接用于下一轮PCR的模板（不用跑电泳），用全长基因两端的引物扩增。如果参数调整恰当，应该可以做出来。祝实验顺利！ |
5楼2014-06-04 08:15:40
2楼2014-06-03 20:20:23
luwei13566
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 184 (高中生)
- 金币: 4352.9
- 散金: 97
- 红花: 35
- 帖子: 641
- 在线: 261.1小时
- 虫号: 2380655
- 注册: 2013-03-27
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
3楼2014-06-03 21:52:44
purRRRRRRRRR
木虫 (小有名气)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 1891.9
- 散金: 359
- 红花: 4
- 帖子: 207
- 在线: 38.1小时
- 虫号: 1399151
- 注册: 2011-09-12
- 专业: 生物化学
4楼2014-06-03 23:05:48
10