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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助！新人，融合PCR一直融不上！！！
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571900696

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 571900696 at 2014-06-05 08:57:20
匹配片段大致有不到30个，你的意思是说我先分别p三个片段10-15个循环然后取出10μ用于融合的模板？？
...

能问一下你们高保真都用哪些酶吗？？我这一学期就使过taq，其他都不了解

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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11楼2014-06-05 08:58:20
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571900696

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 古月木木 at 2014-06-05 08:37:47
做过SOE,2000多bp的融合不算长，楼主的引物是多长来着，是不是引物的问题

引物已经没法在换了，把所有能用的都试了个遍，都融不上，评论20左右吧

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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12楼2014-06-05 09:00:02
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古月木木

新虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 571900696 at 2014-06-05 09:00:02
引物已经没法在换了，把所有能用的都试了个遍，都融不上，评论20左右吧
...

关键是就是引物，我是做基因敲除的上下游同源臂，2600bp左右，引物是50bp左右，很容易就融合了
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13楼2014-06-05 09:36:38
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-06-05 10:11:14
引用回帖:
12楼: Originally posted by 571900696 at 2014-06-05 09:00:02
引物已经没法在换了，把所有能用的都试了个遍，都融不上，评论20左右吧
...

好酶的话：NEB的Q5，如果是土豪的话直接fusion
TAKARA的primestar系列也够用了。
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大家相互帮助哈
14楼2014-06-05 09:46:42
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571900696

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-05 09:46:42
好酶的话：NEB的Q5，如果是土豪的话直接fusion
TAKARA的primestar系列也够用了。...

嗯嗯好的，谢谢
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15楼2014-06-05 10:08:47
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571900696

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 古月木木 at 2014-06-05 09:36:38
关键是就是引物，我是做基因敲除的上下游同源臂，2600bp左右，引物是50bp左右，很容易就融合了...

但是我引物真的已经不知道该怎么换了。。。。。几乎都试过了，要不就是第一步各片段都P不出来，要不就是现在融不上。。。。。
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16楼2014-06-05 10:22:38
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andywang6137

木虫 (著名写手)
我是来学习的，不过看3，4点样空接近Marker顶部好好友很弱的条带。
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17楼2014-06-05 10:51:25
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by 571900696 at 2014-06-05 10:22:38
但是我引物真的已经不知道该怎么换了。。。。。几乎都试过了，要不就是第一步各片段都P不出来，要不就是现在融不上。。。。。...

如果你的引物连单片段都扩不出来那真的就是你引物的事情了，你的模板是什么？
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大家相互帮助哈
18楼2014-06-05 12:32:12
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lingsheshidu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
571900696(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-06-10 20:52:48
571900696: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2014-06-26 10:53:03
引用回帖:
10楼: Originally posted by 571900696 at 2014-06-05 08:57:20
匹配片段大致有不到30个，你的意思是说我先分别p三个片段10-15个循环然后取出10μ用于融合的模板？？
...

三个片段正常PCR，回收就行，只是要用保真酶。10-15循环说的是融合步骤，每个片段各取50ng-100ng应该差不多，楼主可适当调整。之后，取融合产物，用全长基因两端引物PCR。
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积累知识，抓紧奋斗！
19楼2014-06-05 20:44:22
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571900696

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
18楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-05 12:32:12
如果你的引物连单片段都扩不出来那真的就是你引物的事情了，你的模板是什么？...

重新换了引物后一下子就p出来单独的片段了，但是融合不上。。
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20楼2014-06-09 10:15:41
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