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571900696

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 571900696 at 2014-06-05 08:57:20
匹配片段大致有不到30个,你的意思是说我先分别p三个片段10-15个循环然后取出10μ用于融合的模板??
...

能问一下你们高保真都用哪些酶吗??我这一学期就使过taq,其他都不了解

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
11楼2014-06-05 08:58:20
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571900696

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 古月木木 at 2014-06-05 08:37:47
做过SOE,2000多bp的融合不算长,楼主的引物是多长来着,是不是引物的问题

引物已经没法在换了,把所有能用的都试了个遍,都融不上,评论20左右吧

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
12楼2014-06-05 09:00:02
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古月木木

新虫 (著名写手)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 571900696 at 2014-06-05 09:00:02
引物已经没法在换了,把所有能用的都试了个遍,都融不上,评论20左右吧
...

关键是就是引物,我是做基因敲除的上下游同源臂,2600bp左右,引物是50bp左右,很容易就融合了
13楼2014-06-05 09:36:38
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-06-05 10:11:14
引用回帖:
12楼: Originally posted by 571900696 at 2014-06-05 09:00:02
引物已经没法在换了,把所有能用的都试了个遍,都融不上,评论20左右吧
...

好酶的话:NEB的Q5,如果是土豪的话直接fusion
TAKARA的primestar系列也够用了。
大家相互帮助哈
14楼2014-06-05 09:46:42
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571900696

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
14楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-05 09:46:42
好酶的话:NEB的Q5,如果是土豪的话直接fusion
TAKARA的primestar系列也够用了。...

嗯嗯好的,谢谢
15楼2014-06-05 10:08:47
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571900696

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
13楼: Originally posted by 古月木木 at 2014-06-05 09:36:38
关键是就是引物,我是做基因敲除的上下游同源臂,2600bp左右,引物是50bp左右,很容易就融合了...

但是我引物真的已经不知道该怎么换了。。。。。几乎都试过了,要不就是第一步各片段都P不出来,要不就是现在融不上。。。。。
16楼2014-06-05 10:22:38
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andywang6137

木虫 (著名写手)

我是来学习的,不过看3,4点样空接近Marker顶部好好友很弱的条带。
17楼2014-06-05 10:51:25
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by 571900696 at 2014-06-05 10:22:38
但是我引物真的已经不知道该怎么换了。。。。。几乎都试过了,要不就是第一步各片段都P不出来,要不就是现在融不上。。。。。...

如果你的引物连单片段都扩不出来那真的就是你引物的事情了,你的模板是什么?
大家相互帮助哈
18楼2014-06-05 12:32:12
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lingsheshidu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
571900696(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-06-10 20:52:48
571900696: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2014-06-26 10:53:03
引用回帖:
10楼: Originally posted by 571900696 at 2014-06-05 08:57:20
匹配片段大致有不到30个,你的意思是说我先分别p三个片段10-15个循环然后取出10μ用于融合的模板??
...

三个片段正常PCR,回收就行,只是要用保真酶。10-15循环说的是融合步骤,每个片段各取50ng-100ng应该差不多,楼主可适当调整。之后,取融合产物,用全长基因两端引物PCR。
积累知识,抓紧奋斗!
19楼2014-06-05 20:44:22
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571900696

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
18楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-05 12:32:12
如果你的引物连单片段都扩不出来那真的就是你引物的事情了,你的模板是什么?...

重新换了引物后一下子就p出来单独的片段了,但是融合不上。。
20楼2014-06-09 10:15:41
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