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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助！新人，融合PCR一直融不上！！！
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571900696

金虫 (初入文坛)

[求助] 求助！新人，融合PCR一直融不上！！！ 已有6人参与

我做的是三片段融合，大小分别是1039、720、980，融合片段大小为2739bp，分别先p出来，退货、、退火温度都是53度，然后进行融合，条件是   50μl 体系：
10xPCR buffer                 5μ
dNTP                              5μ
上游正向引物AF1             2μ
下游反向引物AR2             2μ
同源臂1（1039）（7.7ng/μl）             各加50ng左右作为模板
同源臂2（720）（24.6ng/μl）              
同源臂3（980）（11.8ng/μl）              
ddH2O2                      补至50μ
Taq酶                 0.25μ

预变性 94 ℃                           5min
  变性  94 ℃                            30s
  复性  53 ℃                            30s      30个循环
  延伸  72 ℃                            3min
  延伸  72 ℃                            10min
  保存  4℃

一直就融不上，后来降低退火温度升高退火温度都融不上，也设了梯度了，好奇怪三个片段的温度都是53度为什么最后融合53度就是融不上呢？？难道是因为Taq酶加A尾了吗？但是我师兄做的是两片段融合就用的Taq酶啊，就融上了！为毛线！！！！求指点！！！！真是做了一学期了快！

下面上电泳图！
一直都是引物二聚体很亮，目的条带啥也没有！！！！

求助！新人，融合PCR一直融不上！！！
除了marker什么也没p出来的电泳图.jpg
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1楼 2014-06-03 14:25:51
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-06-03 22:26:35
Marker最下面那条带上面还是有一条微弱条带的，LZ你看看大小对不对？如果大小正确可以二次PCR扩增下，用好酶扩增！！
赞一下(1人) 回复此楼
大家相互帮助哈
3楼2014-06-03 21:52:44
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thinkdoll

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-06-03 22:26:28
那就不要三片段融合了呗，浪费的时间都够你一步一步融合的了
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2014-06-03 20:20:23
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purRRRRRRRRR

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-06-05 10:09:57
你这pcr条带跑的也太难看了，我就没见过这么难看的条带，容不出来就对了。2000多bp的不能用taq酶了，必须用高保真的酶，这么简单的事情，难道你师兄没告诉过你吗？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-06-03 23:05:48
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lingsheshidu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2014-06-05 10:10:09
gyesang: 回帖置顶 2014-06-05 10:10:13
571900696: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-06-05 10:28:28
1. 融合PCR最好不要用Taq酶，既然楼主都知道末端加尾的问题。
2. 直接用普通PCR程序恐怕难以扩增出目的条带。不知道你同源臂相互匹配的片段有多长？建议：（1）适当延长退火时间，如果匹配片段比较长，提高退火温度。（2）减少循环数，比如10-15个循环，然后取2-5uL直接用于下一轮PCR的模板（不用跑电泳），用全长基因两端的引物扩增。如果参数调整恰当，应该可以做出来。祝实验顺利！
赞一下(2人) 回复此楼
积累知识，抓紧奋斗！
5楼2014-06-04 08:15:40
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