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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 酶切后跑出的条带这个样子，是酶的问题吗
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红茶小麦

新虫 (初入文坛)

[求助] 酶切后跑出的条带这个样子，是酶的问题吗已有3人参与

一直在做克隆，好几个月了还没做出来，累觉不爱了！我先前用的内切酶是TAKARA的sfi-1 ，快速酶，说50度5分钟就能酶切完全，做了好多次，刚开始也不太明白，跑了胶一条带，以为是酶切完全了，接着做，一直是失败失败失败。。。。。。现在索性酶切过夜，出现了两条带，可是与sal 1 酶切的条带有很大区别，位置差的好远。近几天又切了一次，条带也很奇怪，望各位大神指点迷津，给我点头绪啊
第一张图片是酶切验证，左边的是sal1 切的，右边的是sfi-1切的；第二张图片是sfi-1切的

酶切后跑出的条带这个样子，是酶的问题吗
2014 4 25 pcr yz_副本.jpg


酶切后跑出的条带这个样子，是酶的问题吗-1
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1楼2014-05-12 11:14:04
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红茶小麦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-12 14:42:49
LZ是切的什么？基因，载体，重组质粒？用单酶切的话除非你的模板上有额外的切割位点，一般都是切出来一条带的，LZ切出来两条带本来就已经出问题了。~首先你需要筛查下你的模板上有没有额外切割位点，其次你用快切酶 ...

切得是载体，sfi-1酶切的位点是成对存在的。而且酶切的话应该不会那么完全，有两条带应该也是很正常的吧
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3楼2014-05-13 10:56:29
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2014-05-12 15:20:27
LZ是切的什么？基因，载体，重组质粒？用单酶切的话除非你的模板上有额外的切割位点，一般都是切出来一条带的，LZ切出来两条带本来就已经出问题了。~首先你需要筛查下你的模板上有没有额外切割位点，其次你用快切酶过夜也不对，很容易切花。
TAKARA的快切酶你可以试试37度切割，先切60min，可以拿一个带有sfi-1的质粒做对照，质粒能切开就没问题，模板添加1——2ug。
另外，LZ为什么要用单酶切克隆呢，还是buffer不兼容分步酶切？
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大家相互帮助哈
2楼2014-05-12 14:42:49
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 红茶小麦 at 2014-05-13 10:56:29
切得是载体，sfi-1酶切的位点是成对存在的。而且酶切的话应该不会那么完全，有两条带应该也是很正常的吧...

既然你载体上有两个sfi-1位点，那就应该切出来两个啊，你看看载体的图谱如果切出的大小和图谱上一致就没问题，sal1位点也是两个吧，你sal1的两条带比sfi1的小得多啊，那很明显就是你用sfi-1没切完全，一条是线性带，一条是载体的超螺旋。一条如果切完全了两条带的大小应该正好等于你载体的大小。
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大家相互帮助哈
4楼2014-05-13 13:06:58
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906394648

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶切温度一般不都是37度么
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5楼2014-05-13 20:00:09
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