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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 片段连接到载体后，总在酶切位点处发生缺失
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liangte0705

金虫 (小有名气)

[求助] 片段连接到载体后，总在酶切位点处发生缺失已有3人参与

各位同学，我最近遇到了一个难题。我的一个2900bp大小的片段，通过XhoⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点酶切后，连到POK-12载体上，通过pcr鉴定，片段连入了，但酶切鉴定失败，测序后发现从XhoⅠ开始缺失300多bp碱基。我怀疑是片段和宿主菌发生了重组，因此换了许多感受态，例如DH5α，JM109，HB101,但仍然出现上述问题。已经一个多月了，仍然没有解决，请各位同学帮帮忙，看看是不是有什么方法能够解决，多谢大家了。
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1楼2014-05-09 10:22:22
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liangte0705: 金币+1 2014-05-10 13:51:11
那你PCR鉴定时大小就不正确吧？
XhoI酶切位点完整吗？
不同的情况应该具体分析。
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5楼2014-05-10 10:28:20
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liutonglu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liangte0705: 金币+1, ★有帮助 2014-05-09 21:05:04
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-09 22:47:42
有可能是在你300多bp这个位置有另一个XhoI的酶切位点或者产生了星活性（如果有星活性要减少酶切时间）。所以酶切后跑胶回收要和未切的原始片段一起跑，每一步都确认了就知道原因了。
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2楼2014-05-09 20:19:18
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liangte0705: 金币+1, ★有帮助 2014-05-10 13:50:48
重组的可能性不大，很可能是被切断了，你有分析基因内部酶切位点吗？

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3楼2014-05-10 07:30:30
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
liangte0705: 金币+1 2014-05-10 13:51:18
建议片段先ta克隆后，测序对了再切下来

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2014-05-10 07:31:34
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