应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 研一小硕 构载体吐血求助
141/2返回列表12下一页
查看: 1857  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

残刀无痕

新虫 (初入文坛)

[交流] 研一小硕 构载体吐血求助 已有6人参与

由于本人是农学背景，基本没学分子生物学等课程，不懂的东西太多了，实验一直不太顺，载体构了将近一学期了都没弄出来，还被老板批过！
本人要构两个载体，先从拟南芥基因组中用普通Taq酶扩了两个启动子（后面才知道要用高保真酶啊）。A启动子连上后送去测序，发现有两个碱基突变，不知道能不能用？[/i]B启动子一直连不上，感觉比例、酶切微点什么的没问题啊！不知什么原因？
   现在要不要用Phusion酶从拟南芥中再次扩这两启动子以保证序列完全对呢？[/i]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-05-22 16:50:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

残刀无痕

新虫 (初入文坛)
myprayer: 编辑内容 2013-05-24 09:50
myprayer: 回帖置顶 2013-05-24 09:50:53
引用回帖:
7楼: Originally posted by β内酰胺 at 2013-05-23 15:21:38
最好用高保真酶，我们用的全式金fast pfu，如果要连T载体的话，建议加A后连T载，或者直接用blunt载体。我也试过直接把片段酶切连表达载体，这样做可行，不过最好还是连T载体之后酶切连表达载体比较好。
B启动子的片 ...

B启动子约900bp.我传了A的准确序列及测序序列（含其他元件），您看下要不要重新来过！
第一个附件为A 启动子准确序列。

[ Last edited by myprayer on 2013-5-24 at 09:50 ]
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖附件资源列表

  • 欢迎监督和反馈：小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。
    本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com
  • 附件 1 : A准确序列.txt
    • 2013-05-23 23:01:33, 789 bytes
  • 附件 2 : 1-1.txt
    • 2013-05-23 23:02:03, 1.8 K
9楼2013-05-23 23:02:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhangj0754

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:04:50
我们一般是用TAKARA的PrimeSTAR酶扩，然后连全式金的pEASY-Blunt 载体，测序，再双酶切，我一般切4小时，回收片段测浓度，载体与片段比例一般1：10，载体用100ng左右， 我们用TAKARA的连接酶，20ul 体系，16度一般连16个小时吧。取10ul转化，一般如果用全式金的trans1-T1感受态的话，效率很高的。自已做的感受态的话会稍低一些。不过一般都没什么问题的。
赞一下(2人) 回复此楼
6楼2013-05-23 14:22:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

残刀无痕

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xfliu at 2013-05-22 17:06:26
是TA克隆连接不上吗？

不是，是2300表达载体！
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2013-05-22 17:16:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hb467116237

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:05:13
片段的酶切处理对后续的酶连有很大的影响，要把片段处理好。酶连的时候片段的量可以多点，载体的量少点，以提高碰撞几率

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2013-05-24 00:02:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

xfliu

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-22 20:48:41
是TA克隆连接不上吗？
赞一下 回复此楼
2楼2013-05-22 17:06:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Renavatio

木虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-22 20:48:50
可以先连T载体，测序后酶切，连接到表达载体
赞一下 回复此楼
Undefined！
4楼2013-05-22 20:25:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xfliu

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 残刀无痕 at 2013-05-22 17:16:17
不是，是2300表达载体！...

按4楼说的，先TA克隆，再酶切连接2300
赞一下 回复此楼
5楼2013-05-23 11:00:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:05:00
本帖仅楼主可见
赞一下
7楼2013-05-23 15:21:38
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

残刀无痕

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by β内酰胺 at 2013-05-23 15:21:38
最好用高保真酶，我们用的全式金fast pfu，如果要连T载体的话，建议加A后连T载，或者直接用blunt载体。我也试过直接把片段酶切连表达载体，这样做可行，不过最好还是连T载体之后酶切连表达载体比较好。
B启动子的片 ...

B启动子约900bp，高人帮忙看看吧。上传了A启动子的准确序列，与连接后测序的序列，看看要不要重来？

[ Last edited by 残刀无痕 on 2013-5-23 at 22:55 ]
赞一下 回复此楼
8楼2013-05-23 22:49:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 残刀无痕 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 293求调剂 +9 zjl的号 2026-03-16 14/700 2026-03-18 05:13 by qytt腾飞
[考研] 085601材料工程专硕求调剂 +5 慕寒mio 2026-03-16 5/250 2026-03-17 21:31 by hmn_wj
[考研] 302求调剂 +9 负心者当诛 2026-03-11 9/450 2026-03-17 17:13 by ruiyingmiao
[考研] 085600材料与化工求调剂 +5 绪幸与子 2026-03-17 5/250 2026-03-17 16:40 by laoshidan
[考研] 有没有道铁/土木的想调剂南林，给自己招师弟中～ +3 TqlXswl 2026-03-16 7/350 2026-03-17 15:23 by TqlXswl
[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自动化所实习 +6 Losir 2026-03-12 7/350 2026-03-17 12:09 by danranxie
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +7 邱gl 2026-03-11 8/400 2026-03-17 09:36 by 努力学习赚彩礼
[考研] 304求调剂 +3 曼殊2266 2026-03-14 3/150 2026-03-16 16:39 by houyaoxu
[考研] 一志愿华中师范071000，325求调剂 +6 RuitingC 2026-03-12 6/300 2026-03-16 14:50 by 可淡不可忘
[考研] 0856专硕279求调剂 +5 加油加油！? 2026-03-15 5/250 2026-03-15 11:58 by 2020015
[考研] 中科大材料与化工319求调剂 +3 孟鑫材料 2026-03-14 3/150 2026-03-14 20:10 by ms629
[考研] 复试调剂 +3 呼呼？~+123456 2026-03-14 3/150 2026-03-14 16:53 by WTUChen
[考研] 328求调剂 +3 5201314Lsy！ 2026-03-13 6/300 2026-03-14 15:31 by hyswxzs
[考研] 297求调剂 +4 学海漂泊 2026-03-13 4/200 2026-03-14 11:51 by 热情沙漠
[考研] ［0860］321分求调剂，ab区皆可 +4 宝贵热 2026-03-13 4/200 2026-03-13 22:01 by 星空星月
[考研] 材料工程调剂 +4 咪咪空空 2026-03-11 4/200 2026-03-13 19:57 by JourneyLucky
[考研] 考研调剂 +4 芬达46 2026-03-12 4/200 2026-03-13 16:04 by ruiyingmiao
[考研] 求调剂 +3 程雨杭 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:06 by JourneyLucky
[考研] 材料301分求调剂 +5 Liyouyumairs 2026-03-12 5/250 2026-03-13 14:42 by JourneyLucky
[考研] 一志愿山大07化学 332分 四六级已过 本科山东双非 求调剂！ +3 不想理你 2026-03-12 3/150 2026-03-13 14:18 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭