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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 研一小硕 构载体吐血求助
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残刀无痕

新虫 (初入文坛)

[交流] 研一小硕 构载体吐血求助 已有6人参与

由于本人是农学背景，基本没学分子生物学等课程，不懂的东西太多了，实验一直不太顺，载体构了将近一学期了都没弄出来，还被老板批过！
本人要构两个载体，先从拟南芥基因组中用普通Taq酶扩了两个启动子（后面才知道要用高保真酶啊）。A启动子连上后送去测序，发现有两个碱基突变，不知道能不能用？[/i]B启动子一直连不上，感觉比例、酶切微点什么的没问题啊！不知什么原因？
   现在要不要用Phusion酶从拟南芥中再次扩这两启动子以保证序列完全对呢？[/i]
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1楼 2013-05-22 16:50:39
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zhangj0754

木虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:04:50
我们一般是用TAKARA的PrimeSTAR酶扩，然后连全式金的pEASY-Blunt 载体，测序，再双酶切，我一般切4小时，回收片段测浓度，载体与片段比例一般1：10，载体用100ng左右， 我们用TAKARA的连接酶，20ul 体系，16度一般连16个小时吧。取10ul转化，一般如果用全式金的trans1-T1感受态的话，效率很高的。自已做的感受态的话会稍低一些。不过一般都没什么问题的。
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6楼2013-05-23 14:22:43
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残刀无痕

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xfliu at 2013-05-22 17:06:26
是TA克隆连接不上吗？

不是，是2300表达载体！
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3楼2013-05-22 17:16:17
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残刀无痕

新虫 (初入文坛)
myprayer: 编辑内容 2013-05-24 09:50
myprayer: 回帖置顶 2013-05-24 09:50:53
引用回帖:
7楼: Originally posted by β内酰胺 at 2013-05-23 15:21:38
最好用高保真酶，我们用的全式金fast pfu，如果要连T载体的话，建议加A后连T载，或者直接用blunt载体。我也试过直接把片段酶切连表达载体，这样做可行，不过最好还是连T载体之后酶切连表达载体比较好。
B启动子的片 ...

B启动子约900bp.我传了A的准确序列及测序序列（含其他元件），您看下要不要重新来过！
第一个附件为A 启动子准确序列。

[ Last edited by myprayer on 2013-5-24 at 09:50 ]
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  • 附件 1 : A准确序列.txt
    • 2013-05-23 23:01:33, 789 bytes
  • 附件 2 : 1-1.txt
    • 2013-05-23 23:02:03, 1.8 K
9楼2013-05-23 23:02:24
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hb467116237

金虫 (小有名气)
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:05:13
片段的酶切处理对后续的酶连有很大的影响，要把片段处理好。酶连的时候片段的量可以多点，载体的量少点，以提高碰撞几率

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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10楼2013-05-24 00:02:46
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普通回帖

xfliu

银虫 (小有名气)
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-22 20:48:41
是TA克隆连接不上吗？
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2楼2013-05-22 17:06:26
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Renavatio

木虫 (小有名气)
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-22 20:48:50
可以先连T载体，测序后酶切，连接到表达载体
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Undefined！
4楼2013-05-22 20:25:52
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xfliu

银虫 (小有名气)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by 残刀无痕 at 2013-05-22 17:16:17
不是，是2300表达载体！...

按4楼说的，先TA克隆，再酶切连接2300
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5楼2013-05-23 11:00:55
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匿名

用户注销 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:05:00
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7楼2013-05-23 15:21:38
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残刀无痕

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by β内酰胺 at 2013-05-23 15:21:38
最好用高保真酶，我们用的全式金fast pfu，如果要连T载体的话，建议加A后连T载，或者直接用blunt载体。我也试过直接把片段酶切连表达载体，这样做可行，不过最好还是连T载体之后酶切连表达载体比较好。
B启动子的片 ...

B启动子约900bp，高人帮忙看看吧。上传了A启动子的准确序列，与连接后测序的序列，看看要不要重来？

[ Last edited by 残刀无痕 on 2013-5-23 at 22:55 ]
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8楼2013-05-23 22:49:44
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