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残刀无痕

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
帖子: 7
在线: 2.6小时
虫号: 2087312
注册: 2012-10-26
专业: 作物分子育种

[交流] 研一小硕构载体吐血求助已有6人参与

由于本人是农学背景，基本没学分子生物学等课程，不懂的东西太多了，实验一直不太顺，载体构了将近一学期了都没弄出来，还被老板批过！
本人要构两个载体，先从拟南芥基因组中用普通Taq酶扩了两个启动子（后面才知道要用高保真酶啊

）。A启动子连上后送去测序，发现有两个碱基突变，不知道能不能用？[/i]B启动子一直连不上，感觉比例、酶切微点什么的没问题啊！不知什么原因？
现在要不要用Phusion酶从拟南芥中再次扩这两启动子以保证序列完全对呢？[/i]

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1楼 2013-05-22 16:50:39

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zhangj0754

木虫 (小有名气)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 1825.6
帖子: 63
在线: 169.7小时
虫号: 761081
注册: 2009-05-01
性别: GG
专业: 植物营养学

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:04:50

我们一般是用TAKARA的PrimeSTAR酶扩，然后连全式金的pEASY-Blunt 载体，测序，再双酶切，我一般切4小时，回收片段测浓度，载体与片段比例一般1：10，载体用100ng左右，我们用TAKARA的连接酶，20ul 体系，16度一般连16个小时吧。取10ul转化，一般如果用全式金的trans1-T1感受态的话，效率很高的。自已做的感受态的话会稍低一些。不过一般都没什么问题的。