应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 研一小硕 构载体吐血求助
141/2返回列表12下一页
查看: 1838  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

残刀无痕

新虫 (初入文坛)

[交流] 研一小硕 构载体吐血求助 已有6人参与

由于本人是农学背景，基本没学分子生物学等课程，不懂的东西太多了，实验一直不太顺，载体构了将近一学期了都没弄出来，还被老板批过！
本人要构两个载体，先从拟南芥基因组中用普通Taq酶扩了两个启动子（后面才知道要用高保真酶啊）。A启动子连上后送去测序，发现有两个碱基突变，不知道能不能用？[/i]B启动子一直连不上，感觉比例、酶切微点什么的没问题啊！不知什么原因？
   现在要不要用Phusion酶从拟南芥中再次扩这两启动子以保证序列完全对呢？[/i]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-05-22 16:50:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhangj0754

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:04:50
我们一般是用TAKARA的PrimeSTAR酶扩，然后连全式金的pEASY-Blunt 载体，测序，再双酶切，我一般切4小时，回收片段测浓度，载体与片段比例一般1：10，载体用100ng左右， 我们用TAKARA的连接酶，20ul 体系，16度一般连16个小时吧。取10ul转化，一般如果用全式金的trans1-T1感受态的话，效率很高的。自已做的感受态的话会稍低一些。不过一般都没什么问题的。
赞一下(2人) 回复此楼
6楼2013-05-23 14:22:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

残刀无痕

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xfliu at 2013-05-22 17:06:26
是TA克隆连接不上吗？

不是，是2300表达载体！
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2013-05-22 17:16:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

残刀无痕

新虫 (初入文坛)
myprayer: 编辑内容 2013-05-24 09:50
myprayer: 回帖置顶 2013-05-24 09:50:53
引用回帖:
7楼: Originally posted by β内酰胺 at 2013-05-23 15:21:38
最好用高保真酶，我们用的全式金fast pfu，如果要连T载体的话，建议加A后连T载，或者直接用blunt载体。我也试过直接把片段酶切连表达载体，这样做可行，不过最好还是连T载体之后酶切连表达载体比较好。
B启动子的片 ...

B启动子约900bp.我传了A的准确序列及测序序列（含其他元件），您看下要不要重新来过！
第一个附件为A 启动子准确序列。

[ Last edited by myprayer on 2013-5-24 at 09:50 ]
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖附件资源列表

  • 欢迎监督和反馈：小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。
    本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com
  • 附件 1 : A准确序列.txt
    • 2013-05-23 23:01:33, 789 bytes
  • 附件 2 : 1-1.txt
    • 2013-05-23 23:02:03, 1.8 K
9楼2013-05-23 23:02:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hb467116237

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:05:13
片段的酶切处理对后续的酶连有很大的影响，要把片段处理好。酶连的时候片段的量可以多点，载体的量少点，以提高碰撞几率

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2013-05-24 00:02:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

xfliu

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-22 20:48:41
是TA克隆连接不上吗？
赞一下 回复此楼
2楼2013-05-22 17:06:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Renavatio

木虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-22 20:48:50
可以先连T载体，测序后酶切，连接到表达载体
赞一下 回复此楼
Undefined！
4楼2013-05-22 20:25:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xfliu

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 残刀无痕 at 2013-05-22 17:16:17
不是，是2300表达载体！...

按4楼说的，先TA克隆，再酶切连接2300
赞一下 回复此楼
5楼2013-05-23 11:00:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:05:00
本帖仅楼主可见
赞一下
7楼2013-05-23 15:21:38
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

残刀无痕

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by β内酰胺 at 2013-05-23 15:21:38
最好用高保真酶，我们用的全式金fast pfu，如果要连T载体的话，建议加A后连T载，或者直接用blunt载体。我也试过直接把片段酶切连表达载体，这样做可行，不过最好还是连T载体之后酶切连表达载体比较好。
B启动子的片 ...

B启动子约900bp，高人帮忙看看吧。上传了A启动子的准确序列，与连接后测序的序列，看看要不要重来？

[ Last edited by 残刀无痕 on 2013-5-23 at 22:55 ]
赞一下 回复此楼
8楼2013-05-23 22:49:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 残刀无痕 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 情人节自我反思：在爱情中有过遗憾吗？ +5 瞬息宇宙 2026-02-15 6/300 2026-02-18 12:51 by 月下雪林
[找工作] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 i3cz6qj6l2 2026-02-17 3/150 2026-02-18 11:09 by lqtl9djx19
[考博] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 i3cz6qj6l2 2026-02-17 3/150 2026-02-18 10:54 by lqtl9djx19
[考研] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 i3cz6qj6l2 2026-02-17 3/150 2026-02-18 10:39 by lqtl9djx19
[考研] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 pnpwoqbg8f 2026-02-17 3/150 2026-02-18 08:53 by lqtl9djx19
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 pnpwoqbg8f 2026-02-17 3/150 2026-02-18 08:38 by lqtl9djx19
[找工作] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +4 pnpwoqbg8f 2026-02-17 4/200 2026-02-18 07:55 by lotyj5cz79
[基金申请] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 pnpwoqbg8f 2026-02-16 4/200 2026-02-18 07:40 by lotyj5cz79
[考研] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +4 pnpwoqbg8f 2026-02-16 4/200 2026-02-18 07:38 by lotyj5cz79
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +4 pnpwoqbg8f 2026-02-16 4/200 2026-02-18 07:23 by lotyj5cz79
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +4 pnpwoqbg8f 2026-02-16 4/200 2026-02-18 07:08 by lotyj5cz79
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 pnpwoqbg8f 2026-02-16 3/150 2026-02-18 06:53 by lotyj5cz79
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 pnpwoqbg8f 2026-02-17 3/150 2026-02-18 00:40 by tk2gfblvuz
[找工作] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 pnpwoqbg8f 2026-02-17 4/200 2026-02-18 00:23 by tk2gfblvuz
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8 O5 51O 54,科目齐全,可+急 +3 pnpwoqbg8f 2026-02-17 3/150 2026-02-17 23:40 by tk2gfblvuz
[基金申请] 基金正文30页指的是报告正文还是整个申请书 +3 successhe 2026-02-16 4/200 2026-02-17 20:56 by successhe
[基金申请] 今年春晚有几个节目很不错，点赞！ +5 瞬息宇宙 2026-02-16 6/300 2026-02-17 12:49 by jymy19840415
[微米和纳米] 球磨粉体时遇到了大的问题，请指教！ 10+3 6sbiam 2026-02-12 15/750 2026-02-16 15:03 by tgzxzqj
[基金申请] 过年走亲戚时感受到了所开私家车的鄙视链 +3 瞬息宇宙 2026-02-15 5/250 2026-02-16 14:23 by aspect3000
[硕博家园] 江汉大学解明教授课题组招博士研究生/博士后 +3 cleverlyy 2026-02-12 3/150 2026-02-12 21:02 by qsdf1
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭