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残刀无痕

新虫 (初入文坛)

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虫号: 2087312
注册: 2012-10-26
专业: 作物分子育种

[交流] 研一小硕构载体吐血求助已有6人参与

由于本人是农学背景，基本没学分子生物学等课程，不懂的东西太多了，实验一直不太顺，载体构了将近一学期了都没弄出来，还被老板批过！
本人要构两个载体，先从拟南芥基因组中用普通Taq酶扩了两个启动子（后面才知道要用高保真酶啊

）。A启动子连上后送去测序，发现有两个碱基突变，不知道能不能用？[/i]B启动子一直连不上，感觉比例、酶切微点什么的没问题啊！不知什么原因？
现在要不要用Phusion酶从拟南芥中再次扩这两启动子以保证序列完全对呢？[/i]

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1楼 2013-05-22 16:50:39

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残刀无痕

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

7楼: Originally posted by β内酰胺 at 2013-05-23 15:21:38
最好用高保真酶，我们用的全式金fast pfu，如果要连T载体的话，建议加A后连T载，或者直接用blunt载体。我也试过直接把片段酶切连表达载体，这样做可行，不过最好还是连T载体之后酶切连表达载体比较好。
B启动子的片 ...

B启动子约900bp，高人帮忙看看吧。上传了A启动子的准确序列，与连接后测序的序列，看看要不要重来？

[ Last edited by 残刀无痕 on 2013-5-23 at 22:55 ]