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liangte0705

金虫 (小有名气)

[求助] 片段连接到载体后,总在酶切位点处发生缺失 已有3人参与

各位同学,我最近遇到了一个难题。我的一个2900bp大小的片段,通过XhoⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点酶切后,连到POK-12载体上,通过pcr鉴定,片段连入了,但酶切鉴定失败,测序后发现从XhoⅠ开始缺失300多bp碱基。我怀疑是片段和宿主菌发生了重组,因此换了许多感受态,例如DH5α,JM109,HB101,但仍然出现上述问题。已经一个多月了,仍然没有解决,请各位同学帮帮忙,看看是不是有什么方法能够解决,多谢大家了。
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liutonglu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
liangte0705: 金币+1, 有帮助 2014-05-09 21:05:04
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-09 22:47:42
有可能是在你300多bp这个位置有另一个XhoI的酶切位点或者产生了星活性(如果有星活性要减少酶切时间)。所以酶切后跑胶回收要和未切的原始片段一起跑,每一步都确认了就知道原因了。
2楼2014-05-09 20:19:18
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
liangte0705: 金币+1, 有帮助 2014-05-10 13:50:48
重组的可能性不大,很可能是被切断了,你有分析基因内部酶切位点吗?

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-05-10 07:30:30
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


liangte0705: 金币+1 2014-05-10 13:51:18
建议片段先ta克隆后,测序对了再切下来

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-05-10 07:31:34
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
liangte0705: 金币+1 2014-05-10 13:51:11
那你PCR鉴定时大小就不正确吧?
XhoI酶切位点完整吗?
不同的情况应该具体分析。
5楼2014-05-10 10:28:20
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liangte0705

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-10 07:30:30
重组的可能性不大,很可能是被切断了,你有分析基因内部酶切位点吗?

切断了,怎么连到载体上的呢
6楼2014-05-10 13:49:26
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