| 查看: 4071 | 回复: 9 | ||||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||
[求助]
为什么PCR之后的电泳会出现这样的条带？图片不太清楚，左边三条是内参已有4人参与
|
||||
片段长693bp,去年年底P这段基因还好好的~内参出来了，说明cDNA没问题啊 Image1.jpg |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 核酸生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有111人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
PCR后电泳问题
已经有7人回复- ISSR-PCR标记电泳图
已经有6人回复
- 请帮我看看这是怎么回事吧，跑的pcr之后的电泳图
已经有3人回复
- 急！各位帮忙看看，PCR后跑的琼脂糖凝胶电泳图，条带不清晰原因是什么？
已经有16人回复
- 提取DNA后，PCR电泳无条带
已经有5人回复
- PCR后电泳出现一片亮色，那些亮的东西是什么？
已经有36人回复
- PCR电泳图求解
已经有13人回复
- pcr扩增后的电泳图为什么是这个样子？该如何改进
已经有16人回复
- PCR产物再次PCR无条带 只有弥散
已经有18人回复
- PCR跑电泳只出现marker,附图 哪位大侠分析下原因啊
已经有9人回复
- 荧光定量pcr溶解曲线好几个峰，但是电泳只有一条目的条带，怎么回事
已经有5人回复
- 总dna电泳有条带，但PCR后只有引物二聚体
已经有23人回复
- 这样的电泳图片是否代表PCR扩增成功了？
已经有26人回复
- 急求RT-PCR电泳图分析
已经有22人回复
- SCoT标记的PCR产物的琼脂糖电泳图
已经有7人回复
- PCR电泳图怎么会这样？各位帮忙分析一下吧
已经有12人回复
- 我的PCR电泳图怎么这样的啊。。。
已经有11人回复
- 自己做的PFU高保真酶PCR，胶图如下，没有目的条带？
已经有17人回复
- 3‘RACE inner PCR 电泳结果总是有弥散现象回收条带不成带状什么原因啊？
已经有17人回复
- PCR后电泳条带异常
已经有10人回复
- 大家帮忙分析一下PCR电泳图
已经有14人回复
- 【求助/交流】大家帮忙看下我的PCR电泳图，急！做了7.8次还是这样。
已经有15人回复
- 【求助/交流】目的基因PCR后电泳出现多条带
已经有7人回复
- 【求助/交流】PCR产物酶切后，电泳时遇到的的问题，真心求教！
已经有9人回复
西门吹雪170
荣誉版主 (职业作家)
- MolEPI: 1
- 应助: 92 (初中生)
- 贵宾: 0.982
- 金币: 27278.4
- 散金: 1072
- 红花: 40
- 沙发: 2
- 帖子: 3092
- 在线: 438.7小时
- 虫号: 1209807
- 注册: 2011-02-22
- 性别: MM
- 专业: 认知科学
- 管辖: 分子生物
2楼2014-05-06 17:45:36
3楼2014-05-07 11:46:17
西门吹雪170
荣誉版主 (职业作家)
- MolEPI: 1
- 应助: 92 (初中生)
- 贵宾: 0.982
- 金币: 27278.4
- 散金: 1072
- 红花: 40
- 沙发: 2
- 帖子: 3092
- 在线: 438.7小时
- 虫号: 1209807
- 注册: 2011-02-22
- 性别: MM
- 专业: 认知科学
- 管辖: 分子生物
4楼2014-05-07 13:12:18
jurkat.1640
至尊木虫 (文坛精英)
- MolEPI: 1
- 应助: 905 (博后)
- 金币: 16463.5
- 散金: 1654
- 红花: 120
- 沙发: 39
- 帖子: 14449
- 在线: 2169.9小时
- 虫号: 514340
- 注册: 2008-02-28
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
5楼2014-05-08 09:31:30
youlinglyw
荣誉版主 (著名写手)
一匡天下
-
专家经验: +37 - MolEPI: 1
- 应助: 136 (高中生)
- 贵宾: 0.077
- 金币: 8048.9
- 散金: 8858
- 红花: 208
- 沙发: 2
- 帖子: 1511
- 在线: 263.8小时
- 虫号: 787036
- 注册: 2009-06-04
- 性别: GG
- 专业: 认知科学
- 管辖: 生物科学
6楼2014-05-08 09:41:32
7楼2014-05-09 10:37:20
8楼2014-05-09 10:40:04
jurkat.1640
至尊木虫 (文坛精英)
- MolEPI: 1
- 应助: 905 (博后)
- 金币: 16463.5
- 散金: 1654
- 红花: 120
- 沙发: 39
- 帖子: 14449
- 在线: 2169.9小时
- 虫号: 514340
- 注册: 2008-02-28
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
9楼2014-05-09 11:14:48
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+10, MolEPI+1, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-07-09 09:28:40
西门吹雪170: 金币+10, MolEPI+1, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-07-09 09:28:40
|
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致（作者：凌波丽) 2013年9月24日 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下： I.引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体、或者GC比邻远离50%。对策：重新设计引物。 II.Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。 III.靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因： 1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。 这种非特异性带出现可用以下方法解决： （1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 （2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。 （3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。 （4）重新提取模板DNA。 2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。 对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。 IV.考虑使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。 V.调整变性和退火温度时间。 VI.更换所有缓冲溶液，使用全部新配的缓冲溶液。这点可能太基本了，很不被重视。 VII.适当调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。 VIII.Taq酶的专一性扩增不够。往往一些来源的DNA聚合酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策：改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。 酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。 IX.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。 X.适当减低的dNTP的浓度，可以分梯度进行。 一般的调整顺序（不是绝对的）：若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。同时全部重新配所有的缓冲溶液。 然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度，调整变性和退火温度时间。接着或者与引物调整同时，把酶换成其他类型的DNA聚合酶（高保真酶或者热启动酶）。再往后，检测和重新提取DNA模板（包括用质谱或者电泳检测DNA是否变短，清除酚和SDS，检测模板浓度，必要时要对DNA模板测序）。再往后和使用梯度降低dNTP。最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。一般是最先调整Mg2+ 浓度，最后重新设计引物，其他顺序可变。Mg2+ 浓度与dNTP的浓度一般同方向偶联调节。 XI.适当减少退货时间和提高退火温度。 XII.在反应体系中加入：1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率。 过去，我也回答过PCR非特异性扩增的问题，但是这次回答我在2013年8月14日重新编辑核对的。 XIII.使用巢式PCR。 更正:2楼和3楼：调整镁离子浓度时，可以与dNTP正相关的梯度调整，两者同方向分梯度调节，一般不要反方向调节；但是可以单独镁离子浓度，而dNTP浓度不动；有时候dNTP浓度调整不大时也可以不动镁离子浓度，因为镁离子浓度太高了，可能会增加非特异性扩增，或者有时候就是可以不动dNTP浓度而只调节镁离子浓度也能够增加PCR的专一性。 我参考了yujitianqing的帖子，http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6198669 过去我没有注意到，而后我去查阅了文献，有的文献与yujitianqing的帖子的内容基本上一致，也有些文献与yujitianqing的帖子的内容并不一致。 |
10楼2014-07-09 02:29:57