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xiaozengzeng

金虫 (初入文坛)

[求助] PCR跑电泳只出现marker,附图 哪位大侠分析下原因啊

检测APP/PS1转基因小鼠阴阳性，条带只出现marker,引物母液APP-F15.8皮摩尔每微升，APP-R 15.8皮摩尔每微升,PS1-F 15.9皮摩尔每微升，PS1-R17.8皮摩尔每微升.

八个样品体系，                                             
水         115.2微升
buffer   16微升
DNTPS   8微升
taq         0.8微升
DMSO     8微升
APP-F    6.329微升
APP-R    6.329微升
PS1-F    6.289微升
PS1-R    5.618微升
电泳30分钟，120V。
2012-11-6.jpg
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1楼 2012-11-06 18:09:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2012-11-11 08:41:36
你的模板GC含量很高吗？一般用不着加DMSO的。即使加，一般终浓度为3%，你的感大概有5%吧。还有，感觉你的胶上marker也不怎么亮啊，是不是EB跑没了？
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2楼2012-11-07 08:18:03
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gaoyang636

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2012-11-11 08:41:45
胶图不亮啊，跑胶时间比较长，如果非得跑这么长时间，可以先跑胶，跑完再用染料泡胶。
能模糊地看到一些弥散，应该还是你的PCR基本不工作，如果引物之前可以用，那建议修改一下PCR体系，比如按ls说的，干脆去掉DMSO，调整一下Tm
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3楼2012-11-07 09:11:19
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xiaozengzeng

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-07 08:18:03
你的模板GC含量很高吗？一般用不着加DMSO的。即使加，一般终浓度为3%，你的感大概有5%吧。还有，感觉你的胶上marker也不怎么亮啊，是不是EB跑没了？

EB是电泳跑完了 再染的。
APP-F 5’-GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3’
APP-R 5’-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCC-3’
PS1-F         5’-AAT AGA GAA CGG CAG GAG CA-3’
PS1-R 5’-GCC  ATG  AGG  GCA CTA ATC AT-3’
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4楼2012-11-08 08:40:00
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zjykysm

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2012-11-11 08:41:54
虽然跑得不亮，但是还是很明显没有目的条带，还是PCR的原因，体系和退火条件再优化试试
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5楼2012-11-09 19:00:40
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wangqi20092

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2012-11-11 08:42:11
第一，胶制的不好。第二，PCR模版是什么，如果是DNA，加的有点多了。第三，引物合成单上Tm是多少？你用的是多少？第四，做阳性对照没？如果这些问题都解决了，还不出东西，就是引物不能用。
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6楼2012-11-10 10:21:22
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countingcrow

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2012-11-11 08:42:44
先别跑这么多样品，最好用阳性的样品或者阳性质粒摸索一下PCR条件直到能够作出条带，在大量作，这样太浪费了。
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7楼2012-11-10 10:27:27
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sjs511788199

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2012-11-11 08:42:28
引物二聚体存在，说明引物没有问题，可能是你的模板有问题
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8楼2012-11-10 11:19:00
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choukeitou

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1.gel 浓度过高。
2.genome DNA 的状态不是很好
3.没有 positive control
4.DMSO 的添加也不是必须的。
5.band 有点 smera.

建议用现在的primer，用转基因的小鼠的plasmid DNA 做为positive control, 找到适宜的Tm.
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9楼2012-11-11 08:00:20
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fenghuang2003

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

有引物二聚体，说明酶是没有问题的，体系是work的，怀疑你的primer不是很好，可以先做gradient PCR摸索条件，还不行的话可能就得重新设计primer了
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10楼2012-11-12 17:11:28
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