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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 基因克隆求助！！
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childchou

银虫 (小有名气)

[求助] 基因克隆求助！！ 已有2人参与

小弟克隆一个新的基因在细菌中有的，然后据报道植物中也有潜在的这种基因，水稻种也报道过存在，然后我就用水稻开始做。后面做的时候pcr出来后，切胶回收转化什么的挑单菌落pcr，电泳片段很亮而且大小和我设计引物P出来的大小一样，但是做质粒酶切鉴定只能看到被切开了，但是片段的大小不一样，拿去测序比对后匹配率都小于30%。设计过3次引物了，每次都是片段大小一致但是测序都不对，求教！本人新手，连得载体是PMD19T，大肠杆菌DH5a，设计的引物没有在两端加酶切位点，想先弄出来序列对了后再加酶切位点然后做的，
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boomshakalaka
1楼 2014-04-29 18:46:14
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biology-boy

禁虫 (正式写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
childchou(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-04-29 21:13:23
本帖内容被屏蔽
2楼2014-04-29 19:54:44
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zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
childchou(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-04-29 21:13:31
酶切后片段不一致，有可能是目的片段中含有该酶切位点吧，楼上说的亦有可能
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只有不断地失败才会成功
3楼2014-04-29 20:26:42
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childchou

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biology-boy at 2014-04-29 19:54:44
可能是有重叠片段，大小正好和你的目的片段一样吧。

是说水稻中用我引物p出来的那段大小和我目的片段一样，但是不是我的目的片段？额。。。。感觉概率好小啊，那我应该怎么办，继续设计引物扩吗？
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boomshakalaka
4楼2014-04-30 14:33:45
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childchou

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zep616745243 at 2014-04-29 20:26:42
酶切后片段不一致，有可能是目的片段中含有该酶切位点吧，楼上说的亦有可能

我用双酶切切重组的质粒，选的酶切位点是一个在我的目的片段上的一个是PMD19t的，只是想切出来跑胶看，有木有连上，
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boomshakalaka
5楼2014-04-30 14:36:03
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zep616745243

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by childchou at 2014-04-30 14:36:03
我用双酶切切重组的质粒，选的酶切位点是一个在我的目的片段上的一个是PMD19t的，只是想切出来跑胶看，有木有连上，...

TA克隆是没有方向性的，应该有正反重组子两种吧，而你的酶切位点有一个在目的片段上，所以你切出的片段也有可能是2种情况，个人意见
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只有不断地失败才会成功
6楼2014-04-30 16:28:49
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