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childchou

银虫 (小有名气)

[求助] 基因克隆求助!! 已有2人参与

小弟克隆一个新的基因在细菌中有的,然后据报道植物中也有潜在的这种基因,水稻种也报道过存在,然后我就用水稻开始做。后面做的时候pcr出来后,切胶回收转化什么的挑单菌落pcr,电泳片段很亮而且大小和我设计引物P出来的大小一样,但是做质粒酶切鉴定只能看到被切开了,但是片段的大小不一样,拿去测序比对后匹配率都小于30%。设计过3次引物了,每次都是片段大小一致但是测序都不对,求教!本人新手,连得载体是PMD19T,大肠杆菌DH5a,设计的引物没有在两端加酶切位点,想先弄出来序列对了后再加酶切位点然后做的,
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boomshakalaka
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biology-boy

禁虫 (正式写手)


感谢参与,应助指数 +1
childchou(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-04-29 21:13:23
本帖内容被屏蔽

2楼2014-04-29 19:54:44
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zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
childchou(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-04-29 21:13:31
酶切后片段不一致,有可能是目的片段中含有该酶切位点吧,楼上说的亦有可能
只有不断地失败才会成功
3楼2014-04-29 20:26:42
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childchou

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by biology-boy at 2014-04-29 19:54:44
可能是有重叠片段,大小正好和你的目的片段一样吧。

是说水稻中用我引物p出来的那段大小和我目的片段一样,但是不是我的目的片段?额。。。。感觉概率好小啊,那我应该怎么办,继续设计引物扩吗?
boomshakalaka
4楼2014-04-30 14:33:45
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childchou

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by zep616745243 at 2014-04-29 20:26:42
酶切后片段不一致,有可能是目的片段中含有该酶切位点吧,楼上说的亦有可能

我用双酶切切重组的质粒,选的酶切位点是一个在我的目的片段上的一个是PMD19t的,只是想切出来跑胶看,有木有连上,
boomshakalaka
5楼2014-04-30 14:36:03
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zep616745243

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by childchou at 2014-04-30 14:36:03
我用双酶切切重组的质粒,选的酶切位点是一个在我的目的片段上的一个是PMD19t的,只是想切出来跑胶看,有木有连上,...

TA克隆是没有方向性的,应该有正反重组子两种吧,而你的酶切位点有一个在目的片段上,所以你切出的片段也有可能是2种情况,个人意见
只有不断地失败才会成功
6楼2014-04-30 16:28:49
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