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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 请问在大肠杆菌中表达蛋白时会不会只表达一段目的蛋白？怎么解决呢？求高人指点
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cassiett90

新虫 (初入文坛)

[求助] 请问在大肠杆菌中表达蛋白时会不会只表达一段目的蛋白？怎么解决呢？求高人指点 已有5人参与

我最近一直在试着用大肠杆菌表达一个116个氨基酸的蛋白，前面加了个132个氨基酸的sumo标签，再前面是his标签，放在pET28a中表达，目的蛋白总长度为27.6kD，但跑胶却总是只能得到20kD的主条带，质谱显示只有sumo和那116个里面的前面一截目的蛋白，后面的都对不上，但基因测序没有一点问题，这可能是为什么呢？蛋白表达到一半自己停下了？？去表达其他的了？？怎么会这样呢。。求高人指教啊！！！小女子感激不尽！！！
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1楼 2014-04-13 10:07:33
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resurgam

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
重新抽质粒，其中10ul重新送测序，双向测通，再分析。如果没有问题，就拿同一管质粒再做转化看看表达。看样子好像是发生了移码突变了。
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2楼2014-04-13 11:11:01
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by resurgam at 2014-04-13 11:11:01
重新抽质粒，其中10ul重新送测序，双向测通，再分析。如果没有问题，就拿同一管质粒再做转化看看表达。看样子好像是发生了移码突变了。

有可能载体构建过程中出问题了

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-04-13 12:47:38
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有可能蛋白翻译出来后被降解掉了，或者是碰到稀有密码子、终止密码子什么的翻译中断了。
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4楼2014-04-13 16:32:21
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果你不嫌麻烦可以把SUMO加在一段，然后在另外一段加上HIS，两种方法纯化出来的蛋白就是你想要的全长的蛋白
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行至水穷处，坐看云起时
5楼2014-04-13 18:41:51
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cassiett90

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by resurgam at 2014-04-13 11:11:01
重新抽质粒，其中10ul重新送测序，双向测通，再分析。如果没有问题，就拿同一管质粒再做转化看看表达。看样子好像是发生了移码突变了。

嗯嗯 这么做过的 提了质粒 测序还是没问题 表达还是不对。。为什么会移码突变呢？原因可能有什么呢？从质粒的碱基序列来看 是没有移码的，我一个个看了的呢
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6楼2014-04-13 22:13:20
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cassiett90

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-13 12:47:38
有可能载体构建过程中出问题了
...

载体构建可能出什么问题呢？从标签和酶切位点 还有目的片段来看确实没移码。。难道表达的时候还是可能会自己移码哦？？
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7楼2014-04-13 22:15:10
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cassiett90

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuderong at 2014-04-13 16:32:21
有可能蛋白翻译出来后被降解掉了，或者是碰到稀有密码子、终止密码子什么的翻译中断了。

嗯嗯！确实有稀有密码子在里面，但是只有10个以内，而且没有连续的，我用的Rosetta菌株，还是不足以拟补稀有密码子的问题？
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8楼2014-04-13 22:17:17
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cassiett90

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by pennchem at 2014-04-13 18:41:51
如果你不嫌麻烦可以把SUMO加在一段，然后在另外一段加上HIS，两种方法纯化出来的蛋白就是你想要的全长的蛋白

可是这样子分两次表达得到的我的两段蛋白？肿么把他们连在一起呢？
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9楼2014-04-13 22:19:29
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

C-端加入SUMO，N端加入HIS，或者反过来，这样你就可以把你的蛋白夹在两者中间，SUMO纯化的保证C端完整，HIS纯化保证N端完整，不是让你两次表达。
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行至水穷处，坐看云起时
10楼2014-04-13 22:31:38
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