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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 请问在大肠杆菌中表达蛋白时会不会只表达一段目的蛋白？怎么解决呢？求高人指点
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cassiett90

新虫 (初入文坛)

[求助] 请问在大肠杆菌中表达蛋白时会不会只表达一段目的蛋白？怎么解决呢？求高人指点 已有5人参与

我最近一直在试着用大肠杆菌表达一个116个氨基酸的蛋白，前面加了个132个氨基酸的sumo标签，再前面是his标签，放在pET28a中表达，目的蛋白总长度为27.6kD，但跑胶却总是只能得到20kD的主条带，质谱显示只有sumo和那116个里面的前面一截目的蛋白，后面的都对不上，但基因测序没有一点问题，这可能是为什么呢？蛋白表达到一半自己停下了？？去表达其他的了？？怎么会这样呢。。求高人指教啊！！！小女子感激不尽！！！
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1楼 2014-04-13 10:07:33
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resurgam

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
重新抽质粒，其中10ul重新送测序，双向测通，再分析。如果没有问题，就拿同一管质粒再做转化看看表达。看样子好像是发生了移码突变了。
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2楼2014-04-13 11:11:01
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resurgam

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cassiett90 at 2014-04-13 22:13:20
嗯嗯 这么做过的 提了质粒 测序还是没问题 表达还是不对。。为什么会移码突变呢？原因可能有什么呢？从质粒的碱基序列来看 是没有移码的，我一个个看了的呢...

表达的蛋白比预计的要小，可能是降解，但你又说：“质谱显示只有sumo和那116个里面的前面一截目的蛋白，后面的都对不上”所以推测是移码突变了，可能插入了1个或2个碱基也可能删除了1个或2个碱基，导致从移码突变位点后的所有氨基酸都变了。
如果你的蛋白仅仅是降解，那么按照10楼的设计，你是可以用western判断的。但如果是突变，除了测序也木有办法了。
你确定你质谱打的没问题？另，序列比对建议用相关软件，还是不要自己一个一个碱基的看了。
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13楼2014-04-14 22:53:57
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