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cassiett90

新虫 (初入文坛)

[求助] 请问在大肠杆菌中表达蛋白时会不会只表达一段目的蛋白?怎么解决呢?求高人指点 已有5人参与

我最近一直在试着用大肠杆菌表达一个116个氨基酸的蛋白,前面加了个132个氨基酸的sumo标签,再前面是his标签,放在pET28a中表达,目的蛋白总长度为27.6kD,但跑胶却总是只能得到20kD的主条带,质谱显示只有sumo和那116个里面的前面一截目的蛋白,后面的都对不上,但基因测序没有一点问题,这可能是为什么呢?蛋白表达到一半自己停下了??去表达其他的了??怎么会这样呢。。求高人指教啊!!!小女子感激不尽!!!
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resurgam

木虫 (著名写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by cassiett90 at 2014-04-13 22:13:20
嗯嗯 这么做过的 提了质粒 测序还是没问题 表达还是不对。。为什么会移码突变呢?原因可能有什么呢?从质粒的碱基序列来看 是没有移码的,我一个个看了的呢...

表达的蛋白比预计的要小,可能是降解,但你又说:“质谱显示只有sumo和那116个里面的前面一截目的蛋白,后面的都对不上”所以推测是移码突变了,可能插入了1个或2个碱基也可能删除了1个或2个碱基,导致从移码突变位点后的所有氨基酸都变了。
如果你的蛋白仅仅是降解,那么按照10楼的设计,你是可以用western判断的。但如果是突变,除了测序也木有办法了。
你确定你质谱打的没问题?另,序列比对建议用相关软件,还是不要自己一个一个碱基的看了。
13楼2014-04-14 22:53:57
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resurgam

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
重新抽质粒,其中10ul重新送测序,双向测通,再分析。如果没有问题,就拿同一管质粒再做转化看看表达。看样子好像是发生了移码突变了。
2楼2014-04-13 11:11:01
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by resurgam at 2014-04-13 11:11:01
重新抽质粒,其中10ul重新送测序,双向测通,再分析。如果没有问题,就拿同一管质粒再做转化看看表达。看样子好像是发生了移码突变了。

有可能载体构建过程中出问题了

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-04-13 12:47:38
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
有可能蛋白翻译出来后被降解掉了,或者是碰到稀有密码子、终止密码子什么的翻译中断了。
4楼2014-04-13 16:32:21
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