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woolley

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

能详细解释下：
”目的蛋白总长度为27.6kD，但跑胶却总是只能得到20kD的主条带，质谱显示只有sumo和那116个里面的前面一截目的蛋白，后面的都对不上“
蛋白在SDS-PAGE上显示比实际要小是常见的现象
你进行质朴测序了吗，怎么知道后面的都对不上？
如果有部分测序的结果，那么分析起来就好很多，移码突变的话，一个方向就三种可能，一种是你的正确序列，还有两种是突变序列，你看看你质谱出来的序列是不是和突变序列一致，如果一致的话就是移码突变，那么，就去看是在哪个位置开始的移码，然后用同义密码子替换啥的，看看有没有效果。

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11楼2014-04-14 11:50:39

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cassiett90

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

10楼: Originally posted by pennchem at 2014-04-13 22:31:38
C-端加入SUMO，N端加入HIS，或者反过来，这样你就可以把你的蛋白夹在两者中间，SUMO纯化的保证C端完整，HIS纯化保证N端完整，不是让你两次表达。

哦哦~可以试一下，可是我加sumo的目的是想帮助蛋白的折叠，不知道这样子还可以帮助不呢。。

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12楼2014-04-14 15:06:40

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resurgam

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引用回帖:

6楼: Originally posted by cassiett90 at 2014-04-13 22:13:20
嗯嗯这么做过的提了质粒测序还是没问题表达还是不对。。为什么会移码突变呢？原因可能有什么呢？从质粒的碱基序列来看是没有移码的，我一个个看了的呢

...

表达的蛋白比预计的要小，可能是降解，但你又说：“质谱显示只有sumo和那116个里面的前面一截目的蛋白，后面的都对不上”所以推测是移码突变了，可能插入了1个或2个碱基也可能删除了1个或2个碱基，导致从移码突变位点后的所有氨基酸都变了。
如果你的蛋白仅仅是降解，那么按照10楼的设计，你是可以用western判断的。但如果是突变，除了测序也木有办法了。
你确定你质谱打的没问题？另，序列比对建议用相关软件，还是不要自己一个一个碱基的看了。

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13楼2014-04-14 22:53:57

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