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woolley

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
能详细解释下:
”目的蛋白总长度为27.6kD,但跑胶却总是只能得到20kD的主条带,质谱显示只有sumo和那116个里面的前面一截目的蛋白,后面的都对不上“
蛋白在SDS-PAGE上显示比实际要小是常见的现象
你进行质朴测序了吗,怎么知道后面的都对不上?
如果有部分测序的结果,那么分析起来就好很多,移码突变的话,一个方向就三种可能,一种是你的正确序列,还有两种是突变序列,你看看你质谱出来的序列是不是和突变序列一致,如果一致的话就是移码突变,那么,就去看是在哪个位置开始的移码,然后用同义密码子替换啥的,看看有没有效果。
11楼2014-04-14 11:50:39
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cassiett90

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by pennchem at 2014-04-13 22:31:38
C-端加入SUMO,N端加入HIS,或者反过来,这样你就可以把你的蛋白夹在两者中间,SUMO纯化的保证C端完整,HIS纯化保证N端完整,不是让你两次表达。

哦哦~可以试一下,可是我加sumo的目的是想帮助蛋白的折叠,不知道这样子还可以帮助不呢。。
12楼2014-04-14 15:06:40
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resurgam

木虫 (著名写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by cassiett90 at 2014-04-13 22:13:20
嗯嗯 这么做过的 提了质粒 测序还是没问题 表达还是不对。。为什么会移码突变呢?原因可能有什么呢?从质粒的碱基序列来看 是没有移码的,我一个个看了的呢...

表达的蛋白比预计的要小,可能是降解,但你又说:“质谱显示只有sumo和那116个里面的前面一截目的蛋白,后面的都对不上”所以推测是移码突变了,可能插入了1个或2个碱基也可能删除了1个或2个碱基,导致从移码突变位点后的所有氨基酸都变了。
如果你的蛋白仅仅是降解,那么按照10楼的设计,你是可以用western判断的。但如果是突变,除了测序也木有办法了。
你确定你质谱打的没问题?另,序列比对建议用相关软件,还是不要自己一个一个碱基的看了。
13楼2014-04-14 22:53:57
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