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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 做蛋白质表达为什么没有条带？
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)

[求助] 做蛋白质表达为什么没有条带？ 已有6人参与

各位师兄师姐，我最近在做基因克隆，即大肠杆菌BL21中某一段基因序列在大肠杆菌中表达，把工程菌构建好之后做SDS-PAGE电泳后，为什么不见有条带表达呢？IPTG的浓度是1 mM/L，到底有哪些方面的原因呢？真心感谢！！
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1楼 2014-04-08 22:12:13
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 鼓励交流 2014-04-09 11:04:47
1. 你设计的时候目的基因的序列与tag之间有终止子或者移码么，这个要确认一下。
2. 诱导的时候条件对吗？包括诱导温度，诱导时候的OD值。
3. 尝试用其他宿主细胞试试。
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3楼2014-04-09 08:37:20
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寻尘

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by luna跃儿弯弯 at 2014-04-10 18:44:47
你好，请问怎么看阅读框是否变化了呢？
...

我是新手描述不太清……就是查载体图谱找到你的酶切插入位点，再看你的插入片段的碱基序列，看载体插入位点和你的目的基因分别编码的氨基酸序列，检查目的基因插入后能不能正常表达，会不会因为插入基因和酶切位点间碱基数目不当导致插入基因的移码突变
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8楼2014-04-11 10:59:04
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Allen206

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-12 00:28:58
表达条件优化下，设置个十八度，转速，诱导剂浓度，有道四小时就够了，不行就是系统不行，换载体和宿主、培养基
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不想说什么，，，，
10楼2014-04-11 15:27:51
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xy656691

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
luna跃儿弯弯(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-12 17:15:25
先少量诱导看下能不能表达，28诱导4个小时就行。IPTG你加了多少？记得要加对照，一个是构建好的载体不加ＩＰＴＧ诱导，一个是空载体。
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12楼2014-04-11 17:02:23
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穆子涵

金虫 (初入文坛)
★ ★
luna跃儿弯弯(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-06-20 10:44:47
引用回帖:
17楼: Originally posted by luna跃儿弯弯 at 2014-04-12 07:33:31
我的是胞内蛋白，怎样才能不产生包含体，为下一步纯化做准备呢？20度，转速150，iptg浓度为0.5mM，可以吗？
...

你可以尝试摸索一下最优的诱导条件，因为不同蛋白的诱导条件可能会有很大差别，不好拿一个准则去衡量所有的。诱导过程中温度、IPTG浓度的影响比较明显，转速适当优化即可，常用的诱导温度有16，25，30，由于37时E.coli正常生长，速度较快，所以不建议，IPTG浓度你可以设置一个梯度，做一下温度和IPTG浓度的交叉实验应该可以找出最佳诱导条件。
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百善孝为先。
19楼2014-04-12 09:57:48
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普通回帖

luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)
补充：基因测序也是没有问题的
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2楼2014-04-08 22:13:05
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寻尘

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 鼓励交流 2014-04-09 11:04:52
目的基因插入载体后阅读框有没有发生改变？
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4楼2014-04-09 10:59:33
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)
啊？不知道，这个该怎么看是否发生改变了呢？求教

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5楼2014-04-10 18:41:36
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by d00614028 at 2014-04-09 08:37:20
1. 你设计的时候目的基因的序列与tag之间有终止子或者移码么，这个要确认一下。
2. 诱导的时候条件对吗？包括诱导温度，诱导时候的OD值。
3. 尝试用其他宿主细胞试试。

我测序结果是完全吻合的，诱导温度37。时间是12小时呀。还有，到底怎么看是否发生移码了呢？谢谢

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6楼2014-04-10 18:44:04
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 寻尘 at 2014-04-09 10:59:33
目的基因插入载体后阅读框有没有发生改变？

你好，请问怎么看阅读框是否变化了呢？

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7楼2014-04-10 18:44:47
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Hliotrope

木虫 (著名写手)
iptg你加了多少？

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Someone
9楼2014-04-11 12:24:34
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