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hjyxm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-12 17:15:17
转化成功了吗?抽质粒酶切没有?如果酶切都没有目的条带,怎么会表达呢?如果酶切正确的话,就考虑换表达载体!
好好工作!
11楼2014-04-11 16:10:00
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xy656691

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
luna跃儿弯弯(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-12 17:15:25
先少量诱导看下能不能表达,28诱导4个小时就行。IPTG你加了多少?记得要加对照,一个是构建好的载体不加IPTG诱导,一个是空载体。
12楼2014-04-11 17:02:23
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by xy656691 at 2014-04-11 17:02:23
先少量诱导看下能不能表达,28诱导4个小时就行。IPTG你加了多少?记得要加对照,一个是构建好的载体不加IPTG诱导,一个是空载体。

0.5mM的IPTG.

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13楼2014-04-11 23:11:32
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by hjyxm at 2014-04-11 16:10:00
转化成功了吗?抽质粒酶切没有?如果酶切都没有目的条带,怎么会表达呢?如果酶切正确的话,就考虑换表达载体!

酶切有东西,验证了。就是倒入到BL21里没有条带了。是把BL21换成别的吗?谢谢

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14楼2014-04-11 23:13:01
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by xy656691 at 2014-04-11 17:02:23
先少量诱导看下能不能表达,28诱导4个小时就行。IPTG你加了多少?记得要加对照,一个是构建好的载体不加IPTG诱导,一个是空载体。

少量大量都没有表达出来

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
15楼2014-04-11 23:37:09
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穆子涵

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


luna跃儿弯弯(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-12 17:16:05
首先确定添加keep质粒的相应抗生素。。
不知道你的目的蛋白是哪一类,胞质蛋白还是膜蛋白?如果是常规胞质蛋白,按照你所描述诱导条件,应该会形成大量包涵体,如果只选取上清,可能就会看不见蛋白。。

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百善孝为先。
16楼2014-04-11 23:57:10
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 穆子涵 at 2014-04-11 23:57:10
首先确定添加keep质粒的相应抗生素。。
不知道你的目的蛋白是哪一类,胞质蛋白还是膜蛋白?如果是常规胞质蛋白,按照你所描述诱导条件,应该会形成大量包涵体,如果只选取上清,可能就会看不见蛋白。。
...

我的是胞内蛋白,怎样才能不产生包含体,为下一步纯化做准备呢?20度,转速150,iptg浓度为0.5mM,可以吗?

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17楼2014-04-12 07:33:31
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 寻尘 at 2014-04-11 10:59:04
我是新手描述不太清……就是查载体图谱找到你的酶切插入位点,再看你的插入片段的碱基序列,看载体插入位点和你的目的基因分别编码的氨基酸序列,检查目的基因插入后能不能正常表达,会不会因为插入基因和酶切位点 ...

嗯呢,好的,但是我问了一下,他们说启动子后和酶切位点前都应该是3的倍数,就是三个碱基的倍数关系。

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18楼2014-04-12 07:38:52
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穆子涵

金虫 (初入文坛)

★ ★
luna跃儿弯弯(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-06-20 10:44:47
引用回帖:
17楼: Originally posted by luna跃儿弯弯 at 2014-04-12 07:33:31
我的是胞内蛋白,怎样才能不产生包含体,为下一步纯化做准备呢?20度,转速150,iptg浓度为0.5mM,可以吗?
...

你可以尝试摸索一下最优的诱导条件,因为不同蛋白的诱导条件可能会有很大差别,不好拿一个准则去衡量所有的。诱导过程中温度、IPTG浓度的影响比较明显,转速适当优化即可,常用的诱导温度有16,25,30,由于37时E.coli正常生长,速度较快,所以不建议,IPTG浓度你可以设置一个梯度,做一下温度和IPTG浓度的交叉实验应该可以找出最佳诱导条件。
百善孝为先。
19楼2014-04-12 09:57:48
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)

引用回帖:
19楼: Originally posted by 穆子涵 at 2014-04-12 09:57:48
你可以尝试摸索一下最优的诱导条件,因为不同蛋白的诱导条件可能会有很大差别,不好拿一个准则去衡量所有的。诱导过程中温度、IPTG浓度的影响比较明显,转速适当优化即可,常用的诱导温度有16,25,30,由于37时E. ...

您好 我想问一下  虽然知道是胞内蛋白 但是我也取上清准备用胞外蛋白来试试看做个对比什么的  上清也经过了沸水煮10分钟这个过程 为什么没有条带出现呢?按理说应该也会有一些胞外蛋白的吧?
20楼2014-04-15 20:10:38
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