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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 做蛋白质表达为什么没有条带？
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hjyxm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-12 17:15:17
转化成功了吗？抽质粒酶切没有？如果酶切都没有目的条带，怎么会表达呢？如果酶切正确的话，就考虑换表达载体！
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好好工作！
11楼2014-04-11 16:10:00
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xy656691

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
luna跃儿弯弯(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-12 17:15:25
先少量诱导看下能不能表达，28诱导4个小时就行。IPTG你加了多少？记得要加对照，一个是构建好的载体不加ＩＰＴＧ诱导，一个是空载体。
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12楼2014-04-11 17:02:23
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by xy656691 at 2014-04-11 17:02:23
先少量诱导看下能不能表达，28诱导4个小时就行。IPTG你加了多少？记得要加对照，一个是构建好的载体不加ＩＰＴＧ诱导，一个是空载体。

0.5mM的IPTG.

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13楼2014-04-11 23:11:32
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by hjyxm at 2014-04-11 16:10:00
转化成功了吗？抽质粒酶切没有？如果酶切都没有目的条带，怎么会表达呢？如果酶切正确的话，就考虑换表达载体！

酶切有东西，验证了。就是倒入到BL21里没有条带了。是把BL21换成别的吗？谢谢

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14楼2014-04-11 23:13:01
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by xy656691 at 2014-04-11 17:02:23
先少量诱导看下能不能表达，28诱导4个小时就行。IPTG你加了多少？记得要加对照，一个是构建好的载体不加ＩＰＴＧ诱导，一个是空载体。

少量大量都没有表达出来

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15楼2014-04-11 23:37:09
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穆子涵

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
luna跃儿弯弯(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-12 17:16:05
首先确定添加keep质粒的相应抗生素。。
不知道你的目的蛋白是哪一类，胞质蛋白还是膜蛋白？如果是常规胞质蛋白，按照你所描述诱导条件，应该会形成大量包涵体，如果只选取上清，可能就会看不见蛋白。。

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百善孝为先。
16楼2014-04-11 23:57:10
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 穆子涵 at 2014-04-11 23:57:10
首先确定添加keep质粒的相应抗生素。。
不知道你的目的蛋白是哪一类，胞质蛋白还是膜蛋白？如果是常规胞质蛋白，按照你所描述诱导条件，应该会形成大量包涵体，如果只选取上清，可能就会看不见蛋白。。
...

我的是胞内蛋白，怎样才能不产生包含体，为下一步纯化做准备呢？20度，转速150，iptg浓度为0.5mM，可以吗？

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17楼2014-04-12 07:33:31
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by 寻尘 at 2014-04-11 10:59:04
我是新手描述不太清……就是查载体图谱找到你的酶切插入位点，再看你的插入片段的碱基序列，看载体插入位点和你的目的基因分别编码的氨基酸序列，检查目的基因插入后能不能正常表达，会不会因为插入基因和酶切位点 ...

嗯呢，好的，但是我问了一下，他们说启动子后和酶切位点前都应该是3的倍数，就是三个碱基的倍数关系。

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18楼2014-04-12 07:38:52
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穆子涵

金虫 (初入文坛)
★ ★
luna跃儿弯弯(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-06-20 10:44:47
引用回帖:
17楼: Originally posted by luna跃儿弯弯 at 2014-04-12 07:33:31
我的是胞内蛋白，怎样才能不产生包含体，为下一步纯化做准备呢？20度，转速150，iptg浓度为0.5mM，可以吗？
...

你可以尝试摸索一下最优的诱导条件，因为不同蛋白的诱导条件可能会有很大差别，不好拿一个准则去衡量所有的。诱导过程中温度、IPTG浓度的影响比较明显，转速适当优化即可，常用的诱导温度有16，25，30，由于37时E.coli正常生长，速度较快，所以不建议，IPTG浓度你可以设置一个梯度，做一下温度和IPTG浓度的交叉实验应该可以找出最佳诱导条件。
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百善孝为先。
19楼2014-04-12 09:57:48
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luna跃儿弯弯

新虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 穆子涵 at 2014-04-12 09:57:48
你可以尝试摸索一下最优的诱导条件，因为不同蛋白的诱导条件可能会有很大差别，不好拿一个准则去衡量所有的。诱导过程中温度、IPTG浓度的影响比较明显，转速适当优化即可，常用的诱导温度有16，25，30，由于37时E. ...

您好 我想问一下  虽然知道是胞内蛋白 但是我也取上清准备用胞外蛋白来试试看做个对比什么的  上清也经过了沸水煮10分钟这个过程 为什么没有条带出现呢？按理说应该也会有一些胞外蛋白的吧？
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20楼2014-04-15 20:10:38
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