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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 测序正确，但是酶切没有条带，而且重组质粒位置不对
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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)

[求助] 测序正确，但是酶切没有条带，而且重组质粒位置不对 已有2人参与

做连接转化后，提取质粒，没有酶切或者pcr检测直接送测序，片段2500bp，正向测序回来有900bp左右，比对后完全一样。为了论文里面的图片，重新进行酶切检测，双酶切后发现没有插入片段，而且目的片段与质粒加起来应该是8000bp左右，但是电泳结果竟然有15000，这是为什么呢？上样的loading buffer为6
x，染料在buffer中，按比例添加loading buffer 染色颜色太浅，故多加了点loading  buffer，这会对结果造成影响吗？请高手们赐教！谢谢！
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1楼 2014-03-31 20:07:01
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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-03-31 20:16:21
做个克隆，测序才测了一半不到就敢用了？还敢往论文里加。。。

你这个，目前听你的描述，不知道是不是你的质粒压根没有被切开，这种没切开的质粒，如果是超螺旋，会比大小小，要是成大圈了，就可以跑得很慢。
你 ...

因为我要连两个片段共表达，师哥说最后的时候在测通，公司最多测800到1000，现在测了一半序列都是对的，师哥说接着向下做。我觉得什么地方出问题了，但是找不到原因。对照我做了，未酶切，双酶切，两个单酶切，图的样子都对，就是条带的大小不对。
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3楼2014-04-01 00:12:43
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 20:28:01
夏末忆雪: 金币+5, ★有帮助 2014-04-19 23:03:27
做个克隆，测序才测了一半不到就敢用了？还敢往论文里加。。。

你这个，目前听你的描述，不知道是不是你的质粒压根没有被切开，这种没切开的质粒，如果是超螺旋，会比大小小，要是成大圈了，就可以跑得很慢。
你先上一个没有酶切的质粒当control，看看你切了和没切有没有区别再说。

loading一般情况下无所谓。
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2楼2014-03-31 20:16:21
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我中箭了

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
夏末忆雪: 金币+5, ★有帮助 2014-04-19 23:03:37
染料添加在6X loading buffer 中，会影响DNA迁移速率，导致条带位置不对，bp size 越大，影响越大。建议把染料加入琼脂糖中。
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4楼2014-04-18 16:51:01
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