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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)

[求助] 测序正确,但是酶切没有条带,而且重组质粒位置不对 已有2人参与

做连接转化后,提取质粒,没有酶切或者pcr检测直接送测序,片段2500bp,正向测序回来有900bp左右,比对后完全一样。为了论文里面的图片,重新进行酶切检测,双酶切后发现没有插入片段,而且目的片段与质粒加起来应该是8000bp左右,但是电泳结果竟然有15000,这是为什么呢?上样的loading buffer为6
x,染料在buffer中,按比例添加loading buffer 染色颜色太浅,故多加了点loading  buffer,这会对结果造成影响吗?请高手们赐教!谢谢!
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流! 2014-03-31 20:28:01
夏末忆雪: 金币+5, 有帮助 2014-04-19 23:03:27
做个克隆,测序才测了一半不到就敢用了?还敢往论文里加。。。

你这个,目前听你的描述,不知道是不是你的质粒压根没有被切开,这种没切开的质粒,如果是超螺旋,会比大小小,要是成大圈了,就可以跑得很慢。
你先上一个没有酶切的质粒当control,看看你切了和没切有没有区别再说。

loading一般情况下无所谓。
2楼2014-03-31 20:16:21
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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-03-31 20:16:21
做个克隆,测序才测了一半不到就敢用了?还敢往论文里加。。。

你这个,目前听你的描述,不知道是不是你的质粒压根没有被切开,这种没切开的质粒,如果是超螺旋,会比大小小,要是成大圈了,就可以跑得很慢。
你 ...

因为我要连两个片段共表达,师哥说最后的时候在测通,公司最多测800到1000,现在测了一半序列都是对的,师哥说接着向下做。我觉得什么地方出问题了,但是找不到原因。对照我做了,未酶切,双酶切,两个单酶切,图的样子都对,就是条带的大小不对。
3楼2014-04-01 00:12:43
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我中箭了

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
夏末忆雪: 金币+5, 有帮助 2014-04-19 23:03:37
染料添加在6X loading buffer 中,会影响DNA迁移速率,导致条带位置不对,bp size 越大,影响越大。建议把染料加入琼脂糖中。
4楼2014-04-18 16:51:01
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