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新虫 (初入文坛)

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虫号: 1923664

[交流] 跪求质粒酶切载体去磷酸化问题！

最近一直在做酶切载体去磷酸化的实验。因为目的载体和要连入的片段都是用SmaI单酶切后，然后在连接，所以载体需要去磷酸化。但做了好多次了都没有连上，但是自连，要不就是不长单克隆。求各位大神，指点。
   我用的是CIAP，TAKARA公司的，
   DNA  2~3μg
   CIAP 1μL
   10×Ap buffer  5μL
      补水至 50μL
替他小体系的也试过
50摄氏度，反应30min。然后PCI，CI抽提，-20摄氏度，乙醇沉淀9h。然后就75%洗，然后用10ul融解。最后回收到的DNA很少。最近一次回收的量是15ng/ul，连接完，涂平板，挑的单克隆摇不起来。
做了好多次，崩溃了，老板催的紧，求指教！！！谢谢

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