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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 跪求质粒酶切载体去磷酸化问题！
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691806321

新虫 (初入文坛)

[交流] 跪求质粒酶切载体去磷酸化问题！

最近一直在做酶切载体去磷酸化的实验。因为目的载体和要连入的片段都是用SmaI单酶切后，然后在连接，所以载体需要去磷酸化。但做了好多次了都没有连上，但是自连，要不就是不长单克隆。求各位大神，指点。
     我用的是CIAP，TAKARA公司的，
       DNA  2~3μg                  
       CIAP 1μL         
       10×Ap buffer  5μL      
        补水至 50μL  
替他小体系的也试过
50摄氏度，反应30min。然后PCI，CI抽提 ，-20摄氏度，乙醇沉淀9h。然后就75%洗，然后用10ul融解。最后回收到的DNA很少。最近一次回收的量是15ng/ul，连接完，涂平板，挑的单克隆摇不起来 。  
做了好多次，崩溃了，老板催的紧，求指教！！！谢谢
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1楼 2014-03-17 15:54:18
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你不会是小蒋吧？？？
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2楼2014-03-17 16:52:36
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