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湖畔狂想

金虫 (小有名气)

[求助] 菌液PCR的假阳性是什么原因造成的？

最近做实验时遇到这样的问题：
       将目的片段与表达载体连接后，转入大肠杆菌，对其菌液PCR验证时有目的条带（同时还做了用水替代菌液的阴性对照，结果没有目的条带），但是再用酶切验证时发现，没有切下目的片段。
       想知道这算假阳性吗？是什么原因造成的？
       求高人指点！万分感谢！
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1楼2014-02-22 10:18:14
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
湖畔狂想: 金币+3 2014-02-24 16:55:26
问题补充，你用什么样的引物做的菌落PCR呢？如果你用的是基因特异引物，那么产生假阳性是因为，你的连接体系里面没有和载体连接的片段也涂在板子上，你挑菌的时候，自然也会挑到那些片段，就会产生假阳性
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2014-02-22 12:53:38
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
以下均为网络资源：
    引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
    靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。
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2楼2014-02-22 10:59:02
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
湖畔狂想: 金币+2 2014-02-24 16:55:34
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-24 18:20:30
PCR很灵敏，所以有点就会检测到，你图的时候，菌液中的阳性片段或链接产物很有可能被你图的到处都是。所以刮胶就会引入污染。
所以阳性的，一般还要二次鉴定，提质粒然后酶切。
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我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！
4楼2014-02-22 13:48:51
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意孤城_

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-24 18:20:38
本事PCR检测阳性克隆的成功率就低，菌液PCR一方面模板里会有整个基因组的干扰，检测效率更低，根据长时间的实验总结，菌液PCR检测很不理想
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5楼2014-02-22 15:24:41
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