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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做完酶切，之后进行连接，转化，可是过夜之后平板上不长菌落，阴性对照也不长菌落
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xiao宁

新虫 (初入文坛)

[求助] 做完酶切，之后进行连接，转化，可是过夜之后平板上不长菌落，阴性对照也不长菌落 已有3人参与

我的酶切体系是  PLL3.7质粒（293.8ng/ul）  3ul
                          XhoI                          0.5ul
                         HpaI                          0.5ul
                         buffer                            1ul
                         H2O                               5ul
混合 37℃水浴  3h
进行0.7 %琼脂糖凝胶电泳 ，切胶回收 连接
连接体系   T4连接酶                 1ul     对照   载体     2ul
                干扰片段（1uM）      5ul              H2O      3ul
                 载体（6.9ng/ui）    2ul
                 buffer                       1ul
                  H2O                        1ul      
混合 16℃ 过夜连接 次日转化
结果 对照版上和实验板上均无菌落出现  
这样的结果以出现好长时间 求高人指教
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1楼 2013-12-28 11:22:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 20:59:13
载体浓度是不是太低了？确定回收到载体片段了吗？做连接的载体用量在50ng为宜。
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2楼2013-12-28 13:27:04
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 20:59:21
换个连接酶试试，我实验室有段时间连不上，换了新酶就连好了。
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hehe
3楼2013-12-28 15:57:12
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lxyzsx

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-28 20:59:29
对照板是什么？做个空质粒转化

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2013-12-28 16:46:04
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xiao宁

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-28 13:27:04
载体浓度是不是太低了？确定回收到载体片段了吗？做连接的载体用量在50ng为宜。

我将剩下的酶切载体跑了个胶  结果条带很好 说明回收到了载体
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5楼2013-12-29 10:50:12
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xiao宁

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2013-12-28 15:57:12
换个连接酶试试，我实验室有段时间连不上，换了新酶就连好了。

连接酶我也换过了  可是依旧没长
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6楼2013-12-29 11:18:23
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xiao宁

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lxyzsx at 2013-12-28 16:46:04
对照板是什么？做个空质粒转化

对照板指的是 酶切的质粒和水
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7楼2013-12-29 11:20:02
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