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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 用扩增cDNA的引物扩增基因组DNA
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

[求助] 用扩增cDNA的引物扩增基因组DNA 已有7人参与

各位亲们，我之前用来扩增cDNA的引物用来扩增基因组DNA，刚开始的时候能得到一条目的条带，但之后几次，同样的条件下，不同的DNA样品，有的会出现一条目的条带，但有的除了目的条带外还会出现好多条条带，其中提取基因组DNA时没有加入RNA酶，将测得序列比对后，以cDNA为模板和以DNA为模板的序列比对结果相似性为99%，但现在我不知道是为什么会有的出现那么多条带，PCR条件都是一样的。各位大神帮帮忙吧~不胜感激
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1楼 2013-12-10 21:10:32
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wcj668899

至尊木虫 (文坛精英)

教师

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
原理需要进一步吃透！
祝你成功！！
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抓紧努力，狠抓重点，省时高效，再创辉煌。
11楼2013-12-12 06:47:15
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-11 09:58:23
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-11 19:32:51
如果你的引物不跨内含子，用cDNA为模板与gDNA为模板p出来的序列理论上是完全相同的。出现多条带的原因可能是引物的特异性不强，与加不加RNA酶处理gDNA无关，因为DNA聚合酶是不能以RNA为模板的，RNA只有反转录成cDNA才能做PCR。
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2楼2013-12-11 09:34:00
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-11 09:34:00
如果你的引物不跨内含子，用cDNA为模板与gDNA为模板p出来的序列理论上是完全相同的。出现多条带的原因可能是引物的特异性不强，与加不加RNA酶处理gDNA无关，因为DNA聚合酶是不能以RNA为模板的，RNA只有反转录成cDNA ...

引物不跨内含子意思是指引物在一个外显子里是吗？如果引物特异性不好，为什么刚开始做的时候都只是批出了一条目的条带，第二次做的时候出现好多条带的情况，这应该不是引物特异性不好的原因吧？还有就是之前用这条引物扩增cDNA也只是出现一条条带，如果引物特异性不好，那不是应该也会出现好多条带吗？麻烦帮我解答一下吧
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3楼2013-12-11 15:23:47
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dongge2013

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-11 19:32:57
基因组的信息量比cDNA的信息量大的多，所以你的引物针对于基因组DNA特异性可能没那么好，你可以去UCSC网站分析下你的引物质量
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4楼2013-12-11 15:39:57
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竹子小小

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-11 19:33:05
你几次的扩增条件是一样的吗？第二次的模板或者引物浓度都一样吗。只要没有内含子，扩出来的都一样。基因组东西多，有杂带也正常
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5楼2013-12-11 16:03:00
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 竹子小小 at 2013-12-11 16:03:00
你几次的扩增条件是一样的吗？第二次的模板或者引物浓度都一样吗。只要没有内含子，扩出来的都一样。基因组东西多，有杂带也正常

除了模板浓度不一样，其他的条件都一样，请问基因组PCR中模板的量一般是多少，我一般都是加入2ul，模板浓度一般为多少啊
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6楼2013-12-11 16:19:48
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dongge2013 at 2013-12-11 15:39:57
基因组的信息量比cDNA的信息量大的多，所以你的引物针对于基因组DNA特异性可能没那么好，你可以去UCSC网站分析下你的引物质量

亲 能具体说一下怎么用UCSC网站分析引物质量吗？还有如果是引物不好，那为什么有的能扩出一条带，而有的扩出很多条带来呢
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7楼2013-12-11 16:22:32
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Genseer

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-11 19:33:15
这个问题的关键是cDNA序列中不包含内含子，而基因组中含内含子，因此设计扩增cDNA的引物用来扩增基因组DNA时，必须考虑内含子的位置。
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8楼2013-12-11 16:28:26
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Genseer at 2013-12-11 16:28:26
这个问题的关键是cDNA序列中不包含内含子，而基因组中含内含子，因此设计扩增cDNA的引物用来扩增基因组DNA时，必须考虑内含子的位置。

但就算是引物跨内含子那不是也只会扩增到的目的条带比理论上的片段长，也不会出现这么多条杂带吧？还有我扩增到的目的条带测序后与设计引物所用的mRNA序列相似性为99%，那这样是不是说明，这个基因没有内含子呢？
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9楼2013-12-11 17:11:29
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2013-12-11 15:23:47
引物不跨内含子意思是指引物在一个外显子里是吗？如果引物特异性不好，为什么刚开始做的时候都只是批出了一条目的条带，第二次做的时候出现好多条带的情况，这应该不是引物特异性不好的原因吧？还有就是之前用这条 ...

是的。一般设计RT-PCR时的引物会设计在不同外显子里，这样很容易区分gDNA扩增产物和cDNA扩增产物。
引物特异性好不好不仅和引物有关，也和扩增的模板有关。设计引物时一般要根据模板来blast。此外，PCR条件控制不严格也可能产生非特异扩增。
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10楼2013-12-12 02:19:09
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