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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 用扩增cDNA的引物扩增基因组DNA
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

[求助] 用扩增cDNA的引物扩增基因组DNA 已有7人参与

各位亲们，我之前用来扩增cDNA的引物用来扩增基因组DNA，刚开始的时候能得到一条目的条带，但之后几次，同样的条件下，不同的DNA样品，有的会出现一条目的条带，但有的除了目的条带外还会出现好多条条带，其中提取基因组DNA时没有加入RNA酶，将测得序列比对后，以cDNA为模板和以DNA为模板的序列比对结果相似性为99%，但现在我不知道是为什么会有的出现那么多条带，PCR条件都是一样的。各位大神帮帮忙吧~不胜感激
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1楼 2013-12-10 21:10:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2013-12-11 15:23:47
引物不跨内含子意思是指引物在一个外显子里是吗？如果引物特异性不好，为什么刚开始做的时候都只是批出了一条目的条带，第二次做的时候出现好多条带的情况，这应该不是引物特异性不好的原因吧？还有就是之前用这条 ...

是的。一般设计RT-PCR时的引物会设计在不同外显子里，这样很容易区分gDNA扩增产物和cDNA扩增产物。
引物特异性好不好不仅和引物有关，也和扩增的模板有关。设计引物时一般要根据模板来blast。此外，PCR条件控制不严格也可能产生非特异扩增。
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10楼2013-12-12 02:19:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-11 09:58:23
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-11 19:32:51
如果你的引物不跨内含子，用cDNA为模板与gDNA为模板p出来的序列理论上是完全相同的。出现多条带的原因可能是引物的特异性不强，与加不加RNA酶处理gDNA无关，因为DNA聚合酶是不能以RNA为模板的，RNA只有反转录成cDNA才能做PCR。
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2楼2013-12-11 09:34:00
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-11 09:34:00
如果你的引物不跨内含子，用cDNA为模板与gDNA为模板p出来的序列理论上是完全相同的。出现多条带的原因可能是引物的特异性不强，与加不加RNA酶处理gDNA无关，因为DNA聚合酶是不能以RNA为模板的，RNA只有反转录成cDNA ...

引物不跨内含子意思是指引物在一个外显子里是吗？如果引物特异性不好，为什么刚开始做的时候都只是批出了一条目的条带，第二次做的时候出现好多条带的情况，这应该不是引物特异性不好的原因吧？还有就是之前用这条引物扩增cDNA也只是出现一条条带，如果引物特异性不好，那不是应该也会出现好多条带吗？麻烦帮我解答一下吧
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3楼2013-12-11 15:23:47
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dongge2013

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-11 19:32:57
基因组的信息量比cDNA的信息量大的多，所以你的引物针对于基因组DNA特异性可能没那么好，你可以去UCSC网站分析下你的引物质量
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4楼2013-12-11 15:39:57
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