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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

[求助] 用扩增cDNA的引物扩增基因组DNA 已有7人参与

各位亲们,我之前用来扩增cDNA的引物用来扩增基因组DNA,刚开始的时候能得到一条目的条带,但之后几次,同样的条件下,不同的DNA样品,有的会出现一条目的条带,但有的除了目的条带外还会出现好多条条带,其中提取基因组DNA时没有加入RNA酶,将测得序列比对后,以cDNA为模板和以DNA为模板的序列比对结果相似性为99%,但现在我不知道是为什么会有的出现那么多条带,PCR条件都是一样的。各位大神帮帮忙吧~不胜感激
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-11 09:34:00
如果你的引物不跨内含子,用cDNA为模板与gDNA为模板p出来的序列理论上是完全相同的。出现多条带的原因可能是引物的特异性不强,与加不加RNA酶处理gDNA无关,因为DNA聚合酶是不能以RNA为模板的,RNA只有反转录成cDNA ...

引物不跨内含子意思是指引物在一个外显子里是吗?如果引物特异性不好,为什么刚开始做的时候都只是批出了一条目的条带,第二次做的时候出现好多条带的情况,这应该不是引物特异性不好的原因吧?还有就是之前用这条引物扩增cDNA也只是出现一条条带,如果引物特异性不好,那不是应该也会出现好多条带吗?麻烦帮我解答一下吧
3楼2013-12-11 15:23:47
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查看全部 19 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-11 09:58:23
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-11 19:32:51
如果你的引物不跨内含子,用cDNA为模板与gDNA为模板p出来的序列理论上是完全相同的。出现多条带的原因可能是引物的特异性不强,与加不加RNA酶处理gDNA无关,因为DNA聚合酶是不能以RNA为模板的,RNA只有反转录成cDNA才能做PCR。
2楼2013-12-11 09:34:00
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dongge2013

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-11 19:32:57
基因组的信息量比cDNA的信息量大的多,所以你的引物针对于基因组DNA特异性可能没那么好,你可以去UCSC网站分析下你的引物质量
4楼2013-12-11 15:39:57
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竹子小小

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-11 19:33:05
你几次的扩增条件是一样的吗?第二次的模板或者引物浓度都一样吗。只要没有内含子,扩出来的都一样。基因组东西多,有杂带也正常
5楼2013-12-11 16:03:00
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