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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定量PCR实验中关于标曲和溶解曲线的问题
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lwm713

新虫 (初入文坛)

[求助] 定量PCR实验中关于标曲和溶解曲线的问题

最近做定量，结果总是不太好，总之有三个大问题：1、标曲不太好（R2太低）；2、扩增效率太高或太低；3、溶解曲线出现多个峰，而且前面的部分呈震荡趋势。
其中水也换过，引物也换过，就是结果不好，蛋都要碎了。。。。
标曲不很好原以为是混的不均匀（原来只用手轻弹十几下用枪混匀十几下），后来标曲稀释的时候用漩涡振荡器混匀，但结果还是不是很好（R2<0.98），而且扩增效率明显增大了很多。。。。
求大神指点迷津！！！
定量PCR实验中关于标曲和溶解曲线的问题
标曲.jpg


定量PCR实验中关于标曲和溶解曲线的问题-1
溶解曲线.jpg
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1楼 2013-11-01 10:25:39
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zzl2516

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-11-01 14:37:00
lwm713: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-11-02 17:54:41
你的扩增曲线怎么样 都能达到平台期么 建议调一下模板和引物的浓度 把标曲的CT值调的提前一点 个人感觉到30了基本都不靠谱，对于扩增效率高的问题 如果现在用的是三步法可以改为二步法，扩增效率会降下来，另外就是反应条件的问题了，你的溶解曲线这么乱，把扩增产物跑电泳分析一下吧
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2楼2013-11-01 11:20:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-11-01 14:37:03
lwm713: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-02 17:54:53
熔解曲线很不平滑，我觉得你的扩增有问题。熔解曲线很少有这么多峰的，通常即使是有引物二聚体，通常也是主峰前面一个小峰。你的引物特异性怎么样，是否是单一产物？如果熔解曲线峰不单一，通常说明有非特异扩增或者引物二聚体，相应的扩增效率会增大。
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3楼2013-11-01 12:28:14
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lwm713

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zzl2516 at 2013-11-01 11:20:38
你的扩增曲线怎么样 都能达到平台期么 建议调一下模板和引物的浓度 把标曲的CT值调的提前一点 个人感觉到30了基本都不靠谱，对于扩增效率高的问题 如果现在用的是三步法可以改为二步法，扩增效率会降下来，另外就是 ...

模板和引物的浓度怎么调才能把标曲的CT值提前一点？
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4楼2013-11-01 14:31:50
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lwm713

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-01 12:28:14
熔解曲线很不平滑，我觉得你的扩增有问题。熔解曲线很少有这么多峰的，通常即使是有引物二聚体，通常也是主峰前面一个小峰。你的引物特异性怎么样，是否是单一产物？如果熔解曲线峰不单一，通常说明有非特异扩增或者 ...

引物是十一的时候刚从生工公司买的，应该没有问题。另外，我的样品是直接提取的DNA，不是扩增产物。难道是设计的质粒的问题？？？
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5楼2013-11-01 14:37:19
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lwm713

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zzl2516 at 2013-11-01 11:20:38
你的扩增曲线怎么样 都能达到平台期么 建议调一下模板和引物的浓度 把标曲的CT值调的提前一点 个人感觉到30了基本都不靠谱，对于扩增效率高的问题 如果现在用的是三步法可以改为二步法，扩增效率会降下来，另外就是 ...

我做的样品是直接提取的DNA样品不是用的扩增产物，还用再跑电泳吗？
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6楼2013-11-01 14:48:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by lwm713 at 2013-11-01 14:37:19
引物是十一的时候刚从生工公司买的，应该没有问题。另外，我的样品是直接提取的DNA，不是扩增产物。难道是设计的质粒的问题？？？...

把PCR产物跑电泳看看是不是一条带。
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7楼2013-11-01 23:50:07
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zzl2516

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by lwm713 at 2013-11-01 14:31:50
模板和引物的浓度怎么调才能把标曲的CT值提前一点？...

提高模板和引物浓度吧。。。这东西要试，具体什么浓度最适合你要多试几次才知道
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8楼2013-11-02 10:48:26
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zzl2516

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by lwm713 at 2013-11-01 14:48:54
我做的样品是直接提取的DNA样品不是用的扩增产物，还用再跑电泳吗？...

你的样品是DNA样品没错 但是现在你溶解曲线这么多峰，很可能是非特异性产物比较多，这个需要你做完定量PCR之后跑电泳确定
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9楼2013-11-02 10:49:29
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Davidzjy

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
跑qPCR之前还是要做个常规PCR对引物质量进行测试 同时也能测试反应条件
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10楼2013-11-02 13:03:09
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