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lwm713

新虫 (初入文坛)

[求助] 定量PCR实验中关于标曲和溶解曲线的问题

最近做定量,结果总是不太好,总之有三个大问题:1、标曲不太好(R2太低);2、扩增效率太高或太低;3、溶解曲线出现多个峰,而且前面的部分呈震荡趋势。
其中水也换过,引物也换过,就是结果不好,蛋都要碎了。。。。
标曲不很好原以为是混的不均匀(原来只用手轻弹十几下用枪混匀十几下),后来标曲稀释的时候用漩涡振荡器混匀,但结果还是不是很好(R2<0.98),而且扩增效率明显增大了很多。。。。
求大神指点迷津!!!
定量PCR实验中关于标曲和溶解曲线的问题
标曲.jpg


定量PCR实验中关于标曲和溶解曲线的问题-1
溶解曲线.jpg
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-11-01 14:37:03
lwm713: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-02 17:54:53
熔解曲线很不平滑,我觉得你的扩增有问题。熔解曲线很少有这么多峰的,通常即使是有引物二聚体,通常也是主峰前面一个小峰。你的引物特异性怎么样,是否是单一产物?如果熔解曲线峰不单一,通常说明有非特异扩增或者引物二聚体,相应的扩增效率会增大。
3楼2013-11-01 12:28:14
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zzl2516

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-11-01 14:37:00
lwm713: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-11-02 17:54:41
你的扩增曲线怎么样 都能达到平台期么 建议调一下模板和引物的浓度 把标曲的CT值调的提前一点 个人感觉到30了基本都不靠谱,对于扩增效率高的问题 如果现在用的是三步法可以改为二步法,扩增效率会降下来,另外就是反应条件的问题了,你的溶解曲线这么乱,把扩增产物跑电泳分析一下吧
2楼2013-11-01 11:20:38
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lwm713

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zzl2516 at 2013-11-01 11:20:38
你的扩增曲线怎么样 都能达到平台期么 建议调一下模板和引物的浓度 把标曲的CT值调的提前一点 个人感觉到30了基本都不靠谱,对于扩增效率高的问题 如果现在用的是三步法可以改为二步法,扩增效率会降下来,另外就是 ...

模板和引物的浓度怎么调才能把标曲的CT值提前一点?
4楼2013-11-01 14:31:50
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lwm713

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-01 12:28:14
熔解曲线很不平滑,我觉得你的扩增有问题。熔解曲线很少有这么多峰的,通常即使是有引物二聚体,通常也是主峰前面一个小峰。你的引物特异性怎么样,是否是单一产物?如果熔解曲线峰不单一,通常说明有非特异扩增或者 ...

引物是十一的时候刚从生工公司买的,应该没有问题。另外,我的样品是直接提取的DNA,不是扩增产物。难道是设计的质粒的问题???
5楼2013-11-01 14:37:19
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