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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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浅歌99

超级版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

[求助] 建库酶切问题求助!!

建BAC文库时,提取了细胞核DNA然后进行低熔点琼脂糖的包埋,制成了这个包埋块。经过蛋白酶K的处理后,进行了不同浓度Hind III 的酶切,酶切了一个小时,之后跑的脉冲电泳,设置的场强为6V/cm,跑了20个小时。得到的这个结果。两侧的泳道是marker,中间泳道是酶切DNA的结果,设置了Hind III 酶的浓度梯度,从左到右分别为0U 2U 4U 6U 8U 10U。但跑出来基本上没有什么差别。很急,周围没有做这方面的,各位大侠指导一下吧!谢了!!
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浅歌99

主管区长

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引用回帖:
8楼: Originally posted by wfmfj at 2013-10-25 18:44:44
胶块可以通过脉冲电泳跑1%低熔点琼脂糖胶回收1M以上的片段再进行后续操作。这样可以去除大部分杂质,只用原来1/10的酶量基本就可以切动,但是不能保证能成功,因为大片段DNA片段里面的杂质成分其实很复杂的,你可以 ...

其实已经重新提过细胞核,但是出现了相同的问题。我用的是蛋白酶K处理48小时,中间更换一次裂解液,有没有可能是蛋白酶处理不够啊?
9楼2013-10-28 08:58:25
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wfmfj

主管区长

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-14 21:46:29
浅歌99: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2013-10-30 09:53:04
有没有设对照?未酶切对照和过量酶切对照都要设。
另外从图上可以看出你的plug质量很差,酶切一个小时也太长了,取1/3 plug做实验的话,正常情况下超过不要15min。可能蛋白、多糖或多酚类物质去除不干净,改善方法再重新制备plug吧。

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扣鼻屎的姿势很帅
2楼2013-10-14 16:23:54
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文库构建

主管区长

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【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-24 19:04:30
构建BAC文库是一件非常复杂工作量的工作,大型BAC文库筛选更是一件庞大的工程。去年我们实验室试做构建过BAC文库,遇到很多疑问,由于项目紧迫,最终还是委托专业公司代做的。文库平均插入片段在100kb以上,均一性良好。文库质量还不错。希望你能顺利完成BAC文库构建筛选工作。
3楼2013-10-17 09:33:25
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浅歌99

管理员

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by wfmfj at 2013-10-14 16:23:54
有没有设对照?未酶切对照和过量酶切对照都要设。
另外从图上可以看出你的plug质量很差,酶切一个小时也太长了,取1/3 plug做实验的话,正常情况下超过不要15min。可能蛋白、多糖或多酚类物质去除不干净,改善方法 ...

好,我试试再做一下。已经制成的胶块还有办法改善一下吗?
4楼2013-10-24 14:37:03
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