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浅歌99

新虫 (初入文坛)

[求助] 建库酶切问题求助!!

建BAC文库时,提取了细胞核DNA然后进行低熔点琼脂糖的包埋,制成了这个包埋块。经过蛋白酶K的处理后,进行了不同浓度Hind III 的酶切,酶切了一个小时,之后跑的脉冲电泳,设置的场强为6V/cm,跑了20个小时。得到的这个结果。两侧的泳道是marker,中间泳道是酶切DNA的结果,设置了Hind III 酶的浓度梯度,从左到右分别为0U 2U 4U 6U 8U 10U。但跑出来基本上没有什么差别。很急,周围没有做这方面的,各位大侠指导一下吧!谢了!!
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wfmfj

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-14 21:46:29
浅歌99: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2013-10-30 09:53:04
有没有设对照?未酶切对照和过量酶切对照都要设。
另外从图上可以看出你的plug质量很差,酶切一个小时也太长了,取1/3 plug做实验的话,正常情况下超过不要15min。可能蛋白、多糖或多酚类物质去除不干净,改善方法再重新制备plug吧。

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扣鼻屎的姿势很帅
2楼2013-10-14 16:23:54
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wfmfj

金虫 (初入文坛)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-10-30 22:09:34
引用回帖:
4楼: Originally posted by 浅歌99 at 2013-10-24 14:37:03
好,我试试再做一下。已经制成的胶块还有办法改善一下吗?...

胶块可以通过脉冲电泳跑1%低熔点琼脂糖胶回收1M以上的片段再进行后续操作。这样可以去除大部分杂质,只用原来1/10的酶量基本就可以切动,但是不能保证能成功,因为大片段DNA片段里面的杂质成分其实很复杂的,你可以试一下,但最好还是重做。
扣鼻屎的姿势很帅
8楼2013-10-25 18:44:44
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wfmfj

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 浅歌99 at 2013-10-28 08:58:25
其实已经重新提过细胞核,但是出现了相同的问题。我用的是蛋白酶K处理48小时,中间更换一次裂解液,有没有可能是蛋白酶处理不够啊?...

不会的,其实一般的材料处理24-48小时就足够了。你用的材料是什么?取的是什么组织?
扣鼻屎的姿势很帅
11楼2013-10-28 14:22:19
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金虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 浅歌99 at 2013-10-28 09:00:40
能不能把你提细胞核的参考方法发我一份,我参考的是罗美中和Rod.A.Wing的文章。非常感谢...

你在网上搜一下张洪斌的文献,上面很详细。发表在NATURE protocol上的。
扣鼻屎的姿势很帅
12楼2013-10-28 14:23:47
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金虫 (初入文坛)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-10-30 22:14:33
引用回帖:
14楼: Originally posted by 浅歌99 at 2013-10-28 16:47:49
是“Construction and screening of BAC libraries made from Brachypodium genomic DNA”么...

详见附件

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扣鼻屎的姿势很帅
15楼2013-10-29 12:23:49
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金虫 (初入文坛)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 浅歌99 at 2013-10-30 09:52:29
试过了  先用低熔点琼脂糖回收可以切动。 非常感谢!!...

祝你好运!
扣鼻屎的姿势很帅
17楼2013-10-30 20:18:02
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