应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 建库酶切问题求助！！
211/3返回列表123下一页
查看: 2252  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

浅歌99

新虫 (初入文坛)

[求助] 建库酶切问题求助！！

建BAC文库时，提取了细胞核DNA然后进行低熔点琼脂糖的包埋，制成了这个包埋块。经过蛋白酶K的处理后，进行了不同浓度Hind III 的酶切，酶切了一个小时，之后跑的脉冲电泳，设置的场强为6V/cm，跑了20个小时。得到的这个结果。两侧的泳道是marker，中间泳道是酶切DNA的结果，设置了Hind III 酶的浓度梯度，从左到右分别为0U 2U 4U 6U 8U 10U。但跑出来基本上没有什么差别。很急，周围没有做这方面的，各位大侠指导一下吧！谢了！！
回复此楼

» 本帖附件资源列表

  • 欢迎监督和反馈：小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。
    本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com
  • 附件 1 : Chen_lab_2013副本.jpg
    • 2013-10-11 21:04:52, 158.15 K

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-10-11 21:06:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
10楼: Originally posted by 浅歌99 at 2013-10-28 09:00:40
能不能把你提细胞核的参考方法发我一份，我参考的是罗美中和Rod.A.Wing的文章。非常感谢...

http://www.nature.com/nprot/jour ... nprot.2011.455.html

nature protocol的文章
赞一下(2人) 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
18楼2013-10-30 22:13:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

浅歌99

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wfmfj at 2013-10-25 18:44:44
胶块可以通过脉冲电泳跑1%低熔点琼脂糖胶回收1M以上的片段再进行后续操作。这样可以去除大部分杂质，只用原来1/10的酶量基本就可以切动，但是不能保证能成功，因为大片段DNA片段里面的杂质成分其实很复杂的，你可以 ...

能不能把你提细胞核的参考方法发我一份，我参考的是罗美中和Rod.A.Wing的文章。非常感谢
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2013-10-28 09:00:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

wfmfj

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-14 21:46:29
浅歌99: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2013-10-30 09:53:04
有没有设对照？未酶切对照和过量酶切对照都要设。
另外从图上可以看出你的plug质量很差，酶切一个小时也太长了，取1/3 plug做实验的话，正常情况下超过不要15min。可能蛋白、多糖或多酚类物质去除不干净，改善方法再重新制备plug吧。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

浅歌99
扣鼻屎的姿势很帅
2楼2013-10-14 16:23:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

文库构建

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-24 19:04:30
构建BAC文库是一件非常复杂工作量的工作，大型BAC文库筛选更是一件庞大的工程。去年我们实验室试做构建过BAC文库，遇到很多疑问，由于项目紧迫，最终还是委托专业公司代做的。文库平均插入片段在100kb以上，均一性良好。文库质量还不错。希望你能顺利完成BAC文库构建筛选工作。
赞一下 回复此楼
3楼2013-10-17 09:33:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

浅歌99

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by wfmfj at 2013-10-14 16:23:54
有没有设对照？未酶切对照和过量酶切对照都要设。
另外从图上可以看出你的plug质量很差，酶切一个小时也太长了，取1/3 plug做实验的话，正常情况下超过不要15min。可能蛋白、多糖或多酚类物质去除不干净，改善方法 ...

好，我试试再做一下。已经制成的胶块还有办法改善一下吗？
赞一下 回复此楼
4楼2013-10-24 14:37:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

浅歌99

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 文库构建 at 2013-10-17 09:33:25
构建BAC文库是一件非常复杂工作量的工作，大型BAC文库筛选更是一件庞大的工程。去年我们实验室试做构建过BAC文库，遇到很多疑问，由于项目紧迫，最终还是委托专业公司代做的。文库平均插入片段在100kb以上，均一性良 ...

真感谢你。我周围没有做过这方面的，感觉现在很无助。如果可以的话，希望以后有问题也能向你请教。
赞一下 回复此楼
5楼2013-10-24 14:39:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

文库构建

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 浅歌99 at 2013-10-24 14:39:42
真感谢你。我周围没有做过这方面的，感觉现在很无助。如果可以的话，希望以后有问题也能向你请教。...

当然可以。
回复此楼
6楼2013-10-24 17:39:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

浅歌99

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 文库构建 at 2013-10-24 17:39:48
当然可以。...

7楼2013-10-24 21:19:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wfmfj

金虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-30 22:09:34
引用回帖:
4楼: Originally posted by 浅歌99 at 2013-10-24 14:37:03
好，我试试再做一下。已经制成的胶块还有办法改善一下吗？...

胶块可以通过脉冲电泳跑1%低熔点琼脂糖胶回收1M以上的片段再进行后续操作。这样可以去除大部分杂质，只用原来1/10的酶量基本就可以切动，但是不能保证能成功，因为大片段DNA片段里面的杂质成分其实很复杂的，你可以试一下，但最好还是重做。
赞一下 回复此楼
扣鼻屎的姿势很帅
8楼2013-10-25 18:44:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

浅歌99

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wfmfj at 2013-10-25 18:44:44
胶块可以通过脉冲电泳跑1%低熔点琼脂糖胶回收1M以上的片段再进行后续操作。这样可以去除大部分杂质，只用原来1/10的酶量基本就可以切动，但是不能保证能成功，因为大片段DNA片段里面的杂质成分其实很复杂的，你可以 ...

其实已经重新提过细胞核，但是出现了相同的问题。我用的是蛋白酶K处理48小时，中间更换一次裂解液，有没有可能是蛋白酶处理不够啊？
赞一下 回复此楼
9楼2013-10-28 08:58:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 浅歌99 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 4/200 2026-08-29 04:18 by gy1nBQXYQJqL
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 3/150 2026-08-29 03:23 by gy1nBQXYQJqL
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +3 gouxfjh 2026-08-28 3/150 2026-08-29 01:01 by jurkat.1640
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-29 00:28 by winsaint
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +4 gdd2018 2026-08-28 9/450 2026-08-28 14:22 by jklily
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +3 bud_bud 2026-08-27 6/300 2026-08-28 11:53 by bud_bud
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[文学芳草园] 梦想 +3 myrtle 2026-08-26 3/150 2026-08-27 10:01 by angelyueyi
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[职场人生] 学生撞见辅导员送外卖，第二天全班都沉默了 +3 鲸鱼融金_浙江_� 2026-08-22 3/150 2026-08-26 09:01 by zzuzxg
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭