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浅歌99

新虫 (初入文坛)

[求助] 建库酶切问题求助！！

建BAC文库时，提取了细胞核DNA然后进行低熔点琼脂糖的包埋，制成了这个包埋块。经过蛋白酶K的处理后，进行了不同浓度Hind III 的酶切，酶切了一个小时，之后跑的脉冲电泳，设置的场强为6V/cm，跑了20个小时。得到的这个结果。两侧的泳道是marker，中间泳道是酶切DNA的结果，设置了Hind III 酶的浓度梯度，从左到右分别为0U 2U 4U 6U 8U 10U。但跑出来基本上没有什么差别。很急，周围没有做这方面的，各位大侠指导一下吧！谢了！！
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1楼 2013-10-11 21:06:58
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
10楼: Originally posted by 浅歌99 at 2013-10-28 09:00:40
能不能把你提细胞核的参考方法发我一份，我参考的是罗美中和Rod.A.Wing的文章。非常感谢...

http://www.nature.com/nprot/jour ... nprot.2011.455.html

nature protocol的文章
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18楼2013-10-30 22:13:39
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浅歌99

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wfmfj at 2013-10-25 18:44:44
胶块可以通过脉冲电泳跑1%低熔点琼脂糖胶回收1M以上的片段再进行后续操作。这样可以去除大部分杂质，只用原来1/10的酶量基本就可以切动，但是不能保证能成功，因为大片段DNA片段里面的杂质成分其实很复杂的，你可以 ...

能不能把你提细胞核的参考方法发我一份，我参考的是罗美中和Rod.A.Wing的文章。非常感谢
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10楼2013-10-28 09:00:40
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普通回帖

wfmfj

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-14 21:46:29
浅歌99: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2013-10-30 09:53:04
有没有设对照？未酶切对照和过量酶切对照都要设。
另外从图上可以看出你的plug质量很差，酶切一个小时也太长了，取1/3 plug做实验的话，正常情况下超过不要15min。可能蛋白、多糖或多酚类物质去除不干净，改善方法再重新制备plug吧。
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浅歌99
扣鼻屎的姿势很帅
2楼2013-10-14 16:23:54
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文库构建

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-24 19:04:30
构建BAC文库是一件非常复杂工作量的工作，大型BAC文库筛选更是一件庞大的工程。去年我们实验室试做构建过BAC文库，遇到很多疑问，由于项目紧迫，最终还是委托专业公司代做的。文库平均插入片段在100kb以上，均一性良好。文库质量还不错。希望你能顺利完成BAC文库构建筛选工作。
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3楼2013-10-17 09:33:25
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浅歌99

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by wfmfj at 2013-10-14 16:23:54
有没有设对照？未酶切对照和过量酶切对照都要设。
另外从图上可以看出你的plug质量很差，酶切一个小时也太长了，取1/3 plug做实验的话，正常情况下超过不要15min。可能蛋白、多糖或多酚类物质去除不干净，改善方法 ...

好，我试试再做一下。已经制成的胶块还有办法改善一下吗？
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4楼2013-10-24 14:37:03
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浅歌99

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 文库构建 at 2013-10-17 09:33:25
构建BAC文库是一件非常复杂工作量的工作，大型BAC文库筛选更是一件庞大的工程。去年我们实验室试做构建过BAC文库，遇到很多疑问，由于项目紧迫，最终还是委托专业公司代做的。文库平均插入片段在100kb以上，均一性良 ...

真感谢你。我周围没有做过这方面的，感觉现在很无助。如果可以的话，希望以后有问题也能向你请教。
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5楼2013-10-24 14:39:42
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文库构建

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 浅歌99 at 2013-10-24 14:39:42
真感谢你。我周围没有做过这方面的，感觉现在很无助。如果可以的话，希望以后有问题也能向你请教。...

当然可以。
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6楼2013-10-24 17:39:48
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浅歌99

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 文库构建 at 2013-10-24 17:39:48
当然可以。...

7楼2013-10-24 21:19:02
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wfmfj

金虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-30 22:09:34
引用回帖:
4楼: Originally posted by 浅歌99 at 2013-10-24 14:37:03
好，我试试再做一下。已经制成的胶块还有办法改善一下吗？...

胶块可以通过脉冲电泳跑1%低熔点琼脂糖胶回收1M以上的片段再进行后续操作。这样可以去除大部分杂质，只用原来1/10的酶量基本就可以切动，但是不能保证能成功，因为大片段DNA片段里面的杂质成分其实很复杂的，你可以试一下，但最好还是重做。
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扣鼻屎的姿势很帅
8楼2013-10-25 18:44:44
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浅歌99

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wfmfj at 2013-10-25 18:44:44
胶块可以通过脉冲电泳跑1%低熔点琼脂糖胶回收1M以上的片段再进行后续操作。这样可以去除大部分杂质，只用原来1/10的酶量基本就可以切动，但是不能保证能成功，因为大片段DNA片段里面的杂质成分其实很复杂的，你可以 ...

其实已经重新提过细胞核，但是出现了相同的问题。我用的是蛋白酶K处理48小时，中间更换一次裂解液，有没有可能是蛋白酶处理不够啊？
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9楼2013-10-28 08:58:25
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