| 查看: 1356 | 回复: 7 | ||
山水88木虫 (正式写手)
|
[求助]
PCR片段量少求教
|
由于要做重组，所以引物设计比较长，50bp同源序列加上20bp PCR引物，但是PCR片段量一直特别少，试了不同的恒定温度或者每循环降0.5度的方法，体系中也加了DMSO，结果都不理想，如图是8个不同的恒定温度结果，中上部亮度渐弱为目的片段，下面就是引物二聚体了，目前体系是2XTaq酶 10ul,质粒2ul,引物1ulX2，DMSO 1ul，ddH2O 5ul.求教各位大侠还有什么可以改进的地方呢？还望不吝赐教，鄙人感激不尽！！！！ 1.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有280人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 融合PCR最后一步做不出来，求救！！！
已经有23人回复
- 求长片段（7.5 kb）PCR扩增方法？
已经有17人回复
- 3个片段的重叠延伸pcr,pcr反应条件？
已经有7人回复
- 重叠PCR引物，两个片段分别回收后存在杂带是怎么回事
已经有4人回复
- 短片段PCR扩增
已经有7人回复
- 如何确定pcr产物是目的片段
已经有19人回复
- 请教PCR产物酶切后是否可以直接过柱纯化而不胶回收？
已经有15人回复
- PCR不出带，求教
已经有14人回复
- 小片段pcr产无 割胶回收
已经有10人回复
- PCR时出现了非目的片段的超大片段条带
已经有16人回复
- 反转录之后PCR扩增片段问题的请教，急急急
已经有5人回复
- 大片段PCR扩增求助
已经有34人回复
- 高GC含量基因片段PCR问题
已经有13人回复
- PCR产物凝胶回收、酶切等问题请教
已经有7人回复
- 二次PCR产物弥散
已经有12人回复
- PCR拖尾怎么办~~~~~
已经有16人回复
- 重叠PCR克隆大片段
已经有4人回复
- 【求助/交流】PCR产物直接纯化，不用胶回收和试剂盒，请问有这种方法吗？
已经有6人回复
- 【求助/交流】求富含GC的片段的PCR条件
已经有10人回复
- 【求助/交流】为什么PCR扩增产物片段长度比设计时的要长很多？
已经有10人回复
- 【求助/交流】关于PCR产物片段的保存！
已经有10人回复
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
2楼2013-10-11 23:58:31
山水88
木虫 (正式写手)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 2526.7
- 散金: 190
- 红花: 2
- 帖子: 389
- 在线: 280.6小时
- 虫号: 1071557
- 注册: 2010-08-09
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
3楼2013-10-12 10:01:10
liyongliangx
铜虫 (小有名气)
- 应助: 24 (小学生)
- 金币: 111.9
- 散金: 65
- 红花: 4
- 帖子: 114
- 在线: 23.5小时
- 虫号: 2225319
- 注册: 2013-01-06
- 性别: GG
- 专业: 口腔颌面组织生物力学和生
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
山水88: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-10-12 17:39:48
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-14 14:26:51
山水88: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-10-28 22:18:54
感谢参与，应助指数 +1
山水88: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-10-12 17:39:48
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-14 14:26:51
山水88: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-10-28 22:18:54
|
首先第一点：你用的是20ul体系，我记得TAQ 酶的说明书上建议的50ul体系是 25ul mix ,1ul引物（20uM）,模板（0.1ng-10ng)/ul 加入1ul 。所以从你可以按着标准体系再重新配制一下。 第二，你的引物是长引物，在PCR的最初的循环中 ，只有与模板互补的那20bp 需要进行退火。所以如果你的退火温度是按着整个引物去设计，那是不合理的。 第三，不同的酶扩增的效率也不一样。 我给你的建议是 1.重新调整体系。2. PCR先进行6个低温的循环，温度按照那20碱基去计算。3. 可以换其他的酶 ，比如KOD系列的 |
4楼2013-10-12 16:13:47
山水88
木虫 (正式写手)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 2526.7
- 散金: 190
- 红花: 2
- 帖子: 389
- 在线: 280.6小时
- 虫号: 1071557
- 注册: 2010-08-09
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
5楼2013-10-12 17:08:42
山水88
木虫 (正式写手)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 2526.7
- 散金: 190
- 红花: 2
- 帖子: 389
- 在线: 280.6小时
- 虫号: 1071557
- 注册: 2010-08-09
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
6楼2013-10-14 13:57:44
liyongliangx
铜虫 (小有名气)
- 应助: 24 (小学生)
- 金币: 111.9
- 散金: 65
- 红花: 4
- 帖子: 114
- 在线: 23.5小时
- 虫号: 2225319
- 注册: 2013-01-06
- 性别: GG
- 专业: 口腔颌面组织生物力学和生
7楼2013-10-14 17:55:48
山水88
木虫 (正式写手)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 2526.7
- 散金: 190
- 红花: 2
- 帖子: 389
- 在线: 280.6小时
- 虫号: 1071557
- 注册: 2010-08-09
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
8楼2013-10-14 19:00:34
20