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山水88木虫 (正式写手)
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[求助]
PCR片段量少求教
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由于要做重组，所以引物设计比较长，50bp同源序列加上20bp PCR引物，但是PCR片段量一直特别少，试了不同的恒定温度或者每循环降0.5度的方法，体系中也加了DMSO，结果都不理想，如图是8个不同的恒定温度结果，中上部亮度渐弱为目的片段，下面就是引物二聚体了，目前体系是2XTaq酶 10ul,质粒2ul,引物1ulX2，DMSO 1ul，ddH2O 5ul.求教各位大侠还有什么可以改进的地方呢？还望不吝赐教，鄙人感激不尽！！！！ 1.jpg |
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山水88
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8楼2013-10-14 19:00:34
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首先第一点：你用的是20ul体系，我记得TAQ 酶的说明书上建议的50ul体系是 25ul mix ,1ul引物（20uM）,模板（0.1ng-10ng)/ul 加入1ul 。所以从你可以按着标准体系再重新配制一下。 第二，你的引物是长引物，在PCR的最初的循环中 ，只有与模板互补的那20bp 需要进行退火。所以如果你的退火温度是按着整个引物去设计，那是不合理的。 第三，不同的酶扩增的效率也不一样。 我给你的建议是 1.重新调整体系。2. PCR先进行6个低温的循环，温度按照那20碱基去计算。3. 可以换其他的酶 ，比如KOD系列的 |
4楼2013-10-12 16:13:47
