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biology-boy

禁虫 (正式写手)
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实验交流

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1楼 2013-10-06 22:40:50
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yumeizhang

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也在做这个，杂带特别多，且条带亮度较弱
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5楼2013-10-16 16:08:08
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梁赢

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
是不是模板浓度太高了，你可以用1μL的试试，之前我们实验室的也有碰到这种情况的，就是这个原因
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2楼2013-10-07 18:58:30
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+10, 鼓励交流 2013-10-07 21:41:41
PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因与对策

2013年8月23日总结（第二次修订，加上序号，使文章的层次清晰，另外修正了错漏之处）
     
    PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
    其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

    其对策有：
  1.减少酶量（一般以2单位Taq DNA聚合酶为基点，分梯度上下调一调，其他酶也差不多如此浓度，可以参考说明书）；加强DNA聚合酶的专一性或调换另一来源的专一性更好的DNA聚合酶。
  2. 增加DNA聚合酶的专一性。
（1）改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。   
（2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油，若此操作引起酶的浓度过高，可以适当加双蒸馏水稀释。
（3）为了加强Taq DNA聚合酶的专一性。 的专一性，可在反应体系中加入：1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以增加Taq DNA聚合酶的稳定性。
3.适当减少dNTP的浓度；减少dNTP的浓度一般需要与降低Mg2+浓度同方向偶联进行，但是不必按同样的比例。
4.适当降低Mg2+浓 度，可以采用梯度递减方式，以每次0.5mol/L递减，但是Mg2+的终浓度不要低于1.0mol/L。
5. 缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。
6.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
7.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。使用热启动模式。使用热启动时可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。
8. 保证PCR反应的DNA模板的质量，要用电泳检测一下分子量和纯度，质量不好则要重新提取和纯化DNA模板；适当增加DNA模板量，减少循环次数。
9.以上措施都不行时，最后就只能重新设计引物，加强引物的专一性。

10.另外楼主的PCR模板是3kd，用普通PCR效果大概不会很理想，应该考虑使用Long-Range PCR。

                                                                          已经仅供参考！
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3楼2013-10-07 21:40:46
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biology-boy

禁虫 (正式写手)
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4楼2013-10-08 08:29:17
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