24小时热门版块排行榜    

查看: 2165  |  回复: 4

biology-boy

禁虫 (正式写手)

本帖内容被屏蔽

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

实验交流

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

梁赢

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
是不是模板浓度太高了,你可以用1μL的试试,之前我们实验室的也有碰到这种情况的,就是这个原因
2楼2013-10-07 18:58:30
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
kx444555: 金币+10, 鼓励交流 2013-10-07 21:41:41
PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因与对策

2013年8月23日总结(第二次修订,加上序号,使文章的层次清晰,另外修正了错漏之处)
     
    PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
    其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。

    其对策有:
  1.减少酶量(一般以2单位Taq DNA聚合酶为基点,分梯度上下调一调,其他酶也差不多如此浓度,可以参考说明书);加强DNA聚合酶的专一性或调换另一来源的专一性更好的DNA聚合酶。
  2. 增加DNA聚合酶的专一性。
(1)改用专一性更强的DNA聚合酶,或者使用两种不同的DNA聚合酶,减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时,酶量不要太大,以免出现特异性扩增。   
(2)酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油,若此操作引起酶的浓度过高,可以适当加双蒸馏水稀释。
(3)为了加强Taq DNA聚合酶的专一性。 的专一性,可在反应体系中加入:1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率,两者可以增加Taq DNA聚合酶的稳定性。
3.适当减少dNTP的浓度;减少dNTP的浓度一般需要与降低Mg2+浓度同方向偶联进行,但是不必按同样的比例。
4.适当降低Mg2+浓 度,可以采用梯度递减方式,以每次0.5mol/L递减,但是Mg2+的终浓度不要低于1.0mol/L。
5. 缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前,不要大范围地变动反应体系的复性温度,要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增,则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。
6.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时,非特异性扩增较多,这时,最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环,退火温度降低1-2度,直至到达正常的Tm附近的退火温度。
7.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。使用热启动模式。使用热启动时可以购买商用的PCR热启动酶,也可以用石蜡隔离模式。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。
8. 保证PCR反应的DNA模板的质量,要用电泳检测一下分子量和纯度,质量不好则要重新提取和纯化DNA模板;适当增加DNA模板量,减少循环次数。
9.以上措施都不行时,最后就只能重新设计引物,加强引物的专一性。

10.另外楼主的PCR模板是3kd,用普通PCR效果大概不会很理想,应该考虑使用Long-Range PCR。

                                                                          已经仅供参考!
3楼2013-10-07 21:40:46
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

biology-boy

禁虫 (正式写手)

本帖内容被屏蔽

4楼2013-10-08 08:29:17
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yumeizhang

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我也在做这个,杂带特别多,且条带亮度较弱
5楼2013-10-16 16:08:08
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 biology-boy 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0703化学调剂 ,六级已过,有科研经历 +7 曦熙兮 2026-03-15 7/350 2026-03-16 16:34 by houyaoxu
[考研] 085600材料与化工 求调剂 +13 enenenhui 2026-03-13 14/700 2026-03-16 15:19 by 了了了了。。
[考研] 材料与化工求调剂 +3 为学666 2026-03-16 3/150 2026-03-16 15:09 by 加号+
[考研] 材料与化工专硕调剂 +3 heming3743 2026-03-16 3/150 2026-03-16 15:05 by peike
[考研] 344求调剂 +3 knight344 2026-03-16 3/150 2026-03-16 09:42 by 无际的草原
[考研] 22408总分284求调剂 +3 InAspic 2026-03-13 3/150 2026-03-15 11:10 by zhq0425
[考研] 268求调剂 +5 一定有学上- 2026-03-14 6/300 2026-03-14 22:20 by 运气yunqi
[考研] 材料与化工 323 英一+数二+物化,一志愿:哈工大 本人本科双一流 +4 自由的_飞翔 2026-03-13 5/250 2026-03-14 19:39 by hmn_wj
[考研] 211本,11408一志愿中科院277分,曾在中科院自动化所实习 +3 Losir 2026-03-12 3/150 2026-03-14 12:11 by 热情沙漠
[考研] 材料080500调剂求收留 +3 一颗meteor 2026-03-13 3/150 2026-03-14 10:54 by peike
[考研] 328,0703考生求调剂,一志愿为东北师范大学 +4 观素律 2026-03-09 5/250 2026-03-14 01:24 by JourneyLucky
[考研] 0856材料与化工309分求调剂 +6 ZyZy…… 2026-03-10 6/300 2026-03-14 00:38 by JourneyLucky
[考研] 0703,333分求调剂 一志愿郑州大学-物理化学 +3 李魔女斗篷 2026-03-11 3/150 2026-03-13 22:24 by JourneyLucky
[考研] 329求调剂 +3 miaodesi 2026-03-12 4/200 2026-03-13 20:53 by 18595523086
[考研] 285化工学硕求调剂(081700) +6 柴郡猫_ 2026-03-12 6/300 2026-03-13 20:46 by hmn_wj
[考研] 332求调剂 +3 Zz版 2026-03-13 3/150 2026-03-13 20:36 by 18595523086
[考研] 296求调剂 +3 大口吃饭 身体健 2026-03-13 3/150 2026-03-13 10:31 by 学员8dgXkO
[考研] 270求调剂 085600材料与化工专硕 +3 YXCT 2026-03-11 3/150 2026-03-13 10:13 by houyaoxu
[考研] 求调剂材料专硕293 +6 段_(:з」∠)_ 2026-03-10 6/300 2026-03-10 18:22 by ms629
[考研] 收调剂 +7 调剂的考研学生 2026-03-10 7/350 2026-03-10 17:57 by 麦茶汤圆
信息提示
请填处理意见