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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 折磨了一个月的测序-重叠峰问题！
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zhghlj

新虫 (小有名气)

[求助] 折磨了一个月的测序-重叠峰问题！

我最近的实验是根据别人文献报道的引物，P四株细菌中可能存在的一个基因。经过摸索退火温度，我已经可以P出单一条带，然后我就把PCR产物直接拿去测序，均显示重叠峰严重，结果为杂合，比对的基因相似也很低。然后我又做了一次重复，条带很单一，很亮，又直接拿去测序，结果相同。
所以这周我选择克隆测序，回收片段，连接载体进行转化，挑阳性克隆培养，在将菌液拿去测序前，我也用引物进行了阳性克隆鉴定，结果条带仍旧很单一。
但是今天的测序结果出来后显示，所有结果均为非单一克隆，其测序的套峰仍旧很严重！
现在我很迷茫，不知道这是为什么，心情也很沮丧，还请大家多多帮助！
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1楼 2013-09-15 12:51:16
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yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-20 20:12:32
“连接载体进行转化，挑阳性克隆培养“ 楼主是否挑的是单克隆？ 理论上来讲，单克隆内有且只有一个序列。不知道楼主操作是否有问题。
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Let'sdoit.
2楼2013-09-15 23:59:18
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zhghlj

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yimingwang at 2013-09-15 23:59:18
“连接载体进行转化，挑阳性克隆培养“ 楼主是否挑的是单克隆？ 理论上来讲，单克隆内有且只有一个序列。不知道楼主操作是否有问题。

可是我挑克隆后用我基因的引物去P只有一条单一的条带呀，怎么公司最后的结果却说是非单克隆呢
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3楼2013-09-16 13:17:53
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yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-20 20:12:36
1.换家公司测序
2.将板子上的单克隆挑出，然后再在板上划线，挑单个克隆试一下。
PCR只有一条带不能一定说明是单克隆。
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Let'sdoit.
4楼2013-09-16 15:33:06
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