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zhghlj

新虫 (小有名气)

[求助] 折磨了一个月的测序-重叠峰问题!

我最近的实验是根据别人文献报道的引物,P四株细菌中可能存在的一个基因。经过摸索退火温度,我已经可以P出单一条带,然后我就把PCR产物直接拿去测序,均显示重叠峰严重,结果为杂合,比对的基因相似也很低。然后我又做了一次重复,条带很单一,很亮,又直接拿去测序,结果相同。
所以这周我选择克隆测序,回收片段,连接载体进行转化,挑阳性克隆培养,在将菌液拿去测序前,我也用引物进行了阳性克隆鉴定,结果条带仍旧很单一。
但是今天的测序结果出来后显示,所有结果均为非单一克隆,其测序的套峰仍旧很严重!
现在我很迷茫,不知道这是为什么,心情也很沮丧,还请大家多多帮助!
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yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-20 20:12:36
1.换家公司测序
2.将板子上的单克隆挑出,然后再在板上划线,挑单个克隆试一下。
PCR只有一条带不能一定说明是单克隆。
Let'sdoit.
4楼2013-09-16 15:33:06
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yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-20 20:12:32
“连接载体进行转化,挑阳性克隆培养“ 楼主是否挑的是单克隆? 理论上来讲,单克隆内有且只有一个序列。不知道楼主操作是否有问题。
Let'sdoit.
2楼2013-09-15 23:59:18
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zhghlj

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yimingwang at 2013-09-15 23:59:18
“连接载体进行转化,挑阳性克隆培养“ 楼主是否挑的是单克隆? 理论上来讲,单克隆内有且只有一个序列。不知道楼主操作是否有问题。

可是我挑克隆后用我基因的引物去P只有一条单一的条带呀,怎么公司最后的结果却说是非单克隆呢
3楼2013-09-16 13:17:53
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