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doughtiness

新虫 (小有名气)

[求助] 重组酵母不表达

最近在做分泌表达实验，已经成功的将外源基因与真菌表达载体pPICZαA连接，并且成功导入了宿主GS115与X33,但是经过连续三天的甲醇诱导后，经SDS-PAGE验证，却发现蛋白没有表达，最近正为这件事心烦，请问大家有遇到过同样的问题吗？请帮忙指点下，万分感激。我当初选用的酶切位点是Kpnl与Xbal。
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1楼 2013-08-09 10:12:03
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anyaxiong

铁杆木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖应助！ 2013-08-26 22:06:01
1.你是怎么确定转化进宿主菌了呢？PCR？还是测序？一般PCR是不太靠谱的，有可能是假阳性。
2.光SDS-PAGE分析是不够的，一般酵母摇瓶小试的话，蛋白表达量是比较低的，可以考虑用WB进一步确定。
3.发酵条件有没有优化，比如pH、甲醇浓度、温度等。
4.你也可以换个载体，比如pPIC9k,pPIC9。
5.线性化酶可以考虑用Sal I。
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爱拼才会赢
2楼2013-08-26 20:59:24
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doughtiness

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by anyaxiong at 2013-08-26 20:59:24
1.你是怎么确定转化进宿主菌了呢？PCR？还是测序？一般PCR是不太靠谱的，有可能是假阳性。
2.光SDS-PAGE分析是不够的，一般酵母摇瓶小试的话，蛋白表达量是比较低的，可以考虑用WB进一步确定。
3.发酵条件有没有优 ...

您好，我最近发现蛋白表达了，但是却没有活力。以前目的基因在大肠杆菌中是有活力的，现在为了完成分泌表达的任务，让目的基因在酵母中表达，但是现在的问题是蛋白表达了，条带很浓，但就是没有活力。呜呜呜……不知道该怎么办了
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3楼2013-10-20 15:14:57
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