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Bella0224

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[求助] 求助——质粒大提跑胶成这样已有2人参与

Marker旁边那个长长的东西就是我提取的质粒。。。。大小10kb左右，用的天根质粒大提试剂盒，肿么会成这样呢。。。

另外平时跑胶的时候，Marker总是一坨一坨的，不像论文上的那种一个条带一个条带的，平时都是配置1%的胶，0.25g加入约30ml的1×TAE，微波炉高火1min，低火1min，为毛Marker还是这样纸呢。。。。

求助各位啊！！！！！

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[ Last edited by 1949stone on 2013-7-9 at 15:08 ]

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1楼 2013-07-08 09:34:51

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ivyvampire

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【答案】应助回帖

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上样量多少啊，会不会太多了？提质粒还没遇到过这情况啊

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5楼2013-07-08 10:37:19

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Bella0224

金虫 (小有名气)

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操作步骤
1. 取100 ml (根据培养菌体的浓度选择合适的量，低拷贝推荐用200 ml) 过夜培养的菌液，
室温10,000 rpm (~11,500×g )离心3 min收集细菌。
注意：菌液较多时，可多次离心并将菌体沉淀收集到一个离心管中。
2. 尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请倒置干净的吸水纸上。
3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入10 ml溶液P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液
器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：请务必彻底混悬，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏
低。
TIANRed试剂的加入对于后续PCR、酶切和测序都没有影响。使用时按照TIANRed：溶
液P1=1:200进行混合，彻底颠倒混匀，混匀后的溶液为澄清的红色。将混匀后的溶液加
入到收集好的菌体中彻底混匀，由于菌体的存在，混匀后的溶液为浑浊的红色。如果提
取质粒后需要进行转染实验，不建议客户在实验中加入TIANRed试剂。
4. 向离心管中加入10 ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，室温放置5 min。
注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，
如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
如果使用了TIANRed，添加P2之后彻底混匀后，溶液的颜色为澄清的紫色。如果在紫
色中混杂有浑浊的红色，则说明裂解不充分，继续混匀直至溶液颜色完全变为澄清的紫
色。
5. 向离心管中加入10 ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色
分散絮状沉淀。然后室温放置10 min左右。10,000 rpm (~11,500×g )离心5-10 min，使
白色沉淀离至管底（可适当增加离心时间），将全部溶液小心倒入过滤器CS1中（请避
免倒入大量沉淀而阻塞过滤器），慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50 ml的管中
（客户自备）。
注意：加入溶液P4后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果离心后倒入过滤器CS1中的
溶液有白色沉淀也不会影响过滤。如果菌体过多（>100 ml），推荐延长离心时间至20-
30 min。
如果使用了TIANRed，添加溶液P4之彻底混匀后，溶液为澄清的黄色，如果在黄色中混
有紫色，则说明复性不充分，继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色。
6. 向滤液中加入0.35倍滤液体积的异丙醇和1/2倍异丙醇体积的5M NaCl，上下颠倒充分混
匀。
注意：若此处无沉淀出现为正常现象。
7. 4℃ 10,000 rpm (~11,500×g )离心30 min，轻轻倒掉上清液，将其倒置在吸水纸上。
8. 向管中加入6 ml 70%乙醇充分漂洗沉淀，4℃ 10,000 rpm (~11,500×g )离心10 min，轻
轻倒掉上清液，将其倒置在吸水纸上。
9. 重复步骤8。
10. 将离心管敞口室温放置10-20 min，使乙醇充分挥发后加入1-1.5 ml 洗脱缓冲液TB，充分
溶解沉淀。
注意：洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在
7.5-8.0范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液用量的多少主要是依据质粒的
拷贝数以及实验所需要的浓度来确定。洗脱缓冲液体积不少于1 ml，体积过小影响回收
效率。DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

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2楼2013-07-08 09:35:19

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