| 查看: 3921 | 回复: 26 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
求助——质粒大提跑胶成这样 已有2人参与
|
||
|
Marker旁边那个长长的东西就是我提取的质粒。。。。大小10kb左右，用的天根质粒大提试剂盒，肿么会成这样呢。。。 另外平时跑胶的时候，Marker总是一坨一坨的，不像论文上的那种一个条带一个条带的，平时都是配置1%的胶，0.25g加入约30ml的1×TAE，微波炉高火1min，低火1min，为毛Marker还是这样纸呢。。。。 求助各位啊！！！！！  A4.png [ Last edited by 1949stone on 2013-7-9 at 15:08 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有205人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 求助——质粒构建问题
已经有10人回复
- 同一平板的单菌落摇菌后提取质粒跑胶不一样大
已经有5人回复
- 提出的质粒跑胶为什么只在2500bp左右，本来应是是5000多bp的？
已经有10人回复
- 纯化后跑胶有杂带
已经有5人回复
- 做双酶切 跑胶后什么都没有 是怎么回事？
已经有19人回复
- 质粒提取有白色沉淀，跑胶却没条带，啥原因？
已经有24人回复
- 求助关于双酶切空载跑胶没有条带！
已经有15人回复
- 神奇的质粒提取，花儿一样神奇的单酶切跑胶！
已经有34人回复
- 新手求助——质粒电泳条带问题
已经有15人回复
- 提不出质粒，不知道出了什么问题，求助……
已经有17人回复
- 求助 双酶切验证阳性克隆的问题
已经有12人回复
- 求助质粒大提配方（自己配试剂）或哪家的质粒大提试剂盒更好
已经有7人回复
- 提取大肠杆菌质粒失败的原因
已经有11人回复
- 【求助/交流】表达载体转化后,提取的质粒和原来不一样了啊
已经有5人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌转化质粒，出来的不是我要的了，怎么回事？
已经有13人回复
- 【求助/交流】质粒构建步骤，回答的好，还有几十金币追加！！！！
已经有13人回复
- 【求助/交流】中提质粒的时候需要加RNA酶吗？
已经有6人回复
- 【求助/交流】求助、质粒酶切没有条带？
已经有18人回复
- 【求助/交流】酶切后无任何条带是什么原因？
已经有8人回复
- 【求助/交流】环状质粒DNA跑胶速率是不是慢于线状DNA？
已经有6人回复
- 【求助/交流】寻高手解答：提取质粒老是降解怎么回事？
已经有12人回复
3楼2013-07-08 09:35:49
|
操作步骤 1. 取100 ml (根据培养菌体的浓度选择合适的量，低拷贝推荐用200 ml) 过夜培养的菌液， 室温10,000 rpm (~11,500×g )离心3 min收集细菌。 注意：菌液较多时，可多次离心并将菌体沉淀收集到一个离心管中。 2. 尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请倒置干净的吸水纸上。 3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入10 ml溶液P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液 器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。 注意：请务必彻底混悬，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏 低。 TIANRed试剂的加入对于后续PCR、酶切和测序都没有影响。使用时按照TIANRed：溶 液P1=1:200进行混合，彻底颠倒混匀，混匀后的溶液为澄清的红色。将混匀后的溶液加 入到收集好的菌体中彻底混匀，由于菌体的存在，混匀后的溶液为浑浊的红色。如果提 取质粒后需要进行转染实验，不建议客户在实验中加入TIANRed试剂。 4. 向离心管中加入10 ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，室温放置5 min。 注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠， 如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。 如果使用了TIANRed，添加P2之后彻底混匀后，溶液的颜色为澄清的紫色。如果在紫 色中混杂有浑浊的红色，则说明裂解不充分，继续混匀直至溶液颜色完全变为澄清的紫 色。 5. 向离心管中加入10 ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色 分散絮状沉淀。然后室温放置10 min左右。10,000 rpm (~11,500×g )离心5-10 min，使 白色沉淀离至管底（可适当增加离心时间），将全部溶液小心倒入过滤器CS1中（请避 免倒入大量沉淀而阻塞过滤器），慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50 ml的管中 （客户自备）。 注意：加入溶液P4后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果离心后倒入过滤器CS1中的 溶液有白色沉淀也不会影响过滤。如果菌体过多（>100 ml），推荐延长离心时间至20- 30 min。 如果使用了TIANRed，添加溶液P4之彻底混匀后，溶液为澄清的黄色，如果在黄色中混 有紫色，则说明复性不充分，继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色。 6. 向滤液中加入0.35倍滤液体积的异丙醇和1/2倍异丙醇体积的5M NaCl，上下颠倒充分混 匀。 注意：若此处无沉淀出现为正常现象。 7. 4℃ 10,000 rpm (~11,500×g )离心30 min，轻轻倒掉上清液，将其倒置在吸水纸上。 8. 向管中加入6 ml 70%乙醇充分漂洗沉淀，4℃ 10,000 rpm (~11,500×g )离心10 min，轻 轻倒掉上清液，将其倒置在吸水纸上。 9. 重复步骤8。 10. 将离心管敞口室温放置10-20 min，使乙醇充分挥发后加入1-1.5 ml 洗脱缓冲液TB，充分 溶解沉淀。 注意：洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在 7.5-8.0范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液用量的多少主要是依据质粒的 拷贝数以及实验所需要的浓度来确定。洗脱缓冲液体积不少于1 ml，体积过小影响回收 效率。DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。 |
2楼2013-07-08 09:35:19
1949stone
荣誉版主 (知名作家)
海纳百川
- MolEPI: 4
- 应助: 95 (初中生)
- 贵宾: 2.38
- 金币: 2627.9
- 散金: 3394
- 红花: 177
- 沙发: 8
- 帖子: 9830
- 在线: 2692.8小时
- 虫号: 765987
- 注册: 2009-05-08
- 性别: GG
- 专业: 药物分析
- 管辖: 分子生物
4楼2013-07-08 10:30:46
ivyvampire
新虫 (正式写手)
- 应助: 32 (小学生)
- 金币: 266.1
- 散金: 71
- 红花: 7
- 帖子: 686
- 在线: 541.4小时
- 虫号: 1716889
- 注册: 2012-03-26
- 专业: 蛋白质组学
5楼2013-07-08 10:37:19
50