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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 有关植物基因条形码及相关的引物设计问题
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xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)

[求助] 有关植物基因条形码及相关的引物设计问题

小弟最近在考虑做植物DNA条形码，也看了一些文献，可是一直在迷茫着一些问题，首先是对整个工作流程把握不是很清楚，其次对某些具体的步骤也有些疑问，还请各位高手指点一番。
   1、 根据我个人的理解，以ITS2的为例，整个过程：总DNA的提取——ITS2的扩增——PCR扩增产物的纯化——进行目标序列的双向测序——具体数据的处理。不知道这个过程中是不是有漏掉的哪些过程，求指导。
   2、 提取总DNA时，有的是使用DNA提取试剂盒，有的则是用CTAB等方法进行提取，请问这有区别么？其次在利用各种不同的分子标记方法时，首先都要提取总DNA，利用这些不同的方法时提取总DNA的方法可以通用吗？
   3、ITS2 为nrDNA，在进行第二步ITS2序列的扩增前不需要把总DNA中的叶绿体DNA先去除么？同样在做叶绿体DNA的片段扩增时，核DNA部去除么？在扩增时他们之间没有影响么？亦或是设计的扩增引物的特异性解决了这个问题呢？
   4、有关扩增引物设计的问题。在针对一段目的基因进行扩增前是不是先要了解它的具体结构和序列，找到两边的保守序列，根据保守序列来设计引物呢？以ITS2为例，它的两边为5.8s和28s基因，均为保守序列，我是不是要查出这两个基因的序列来才能进行引物设计呢？如果我想扩增的是一段不知道序列的基因，也不知道两边是不是有保守序列，这时该怎么设计引物呢？
   5、PCR扩增产物的纯化方法。是用电泳跑胶的方法么？亦或是离心等别的方法？
在这方面我还是新手中的新手，也在不停地看先关的文献，可是这些问题一直萦绕在我心头，自己看文献也看不明白有时越看越迷茫，当中可能会有些不是问题的问题，希望大家帮忙尽量解答一下！谢谢！
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1楼 2013-05-23 15:02:44
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j134104

金虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励跟贴交流！ 2013-05-29 17:55:10
引用回帖:
3楼: Originally posted by xujingyuanxu at 2013-05-28 13:59:53
谢谢您的帮助。可是如果我想扩增的是一段不知道序列的基因，也不知道两边是不是有保守序列，这时该怎么设计引物呢？...

我觉得你还是没说清楚。
1.如果你做的是植物条形码，直接使用条形码的引物就行了，ITS、rbcL、matK、psbA-trnH等序列的引物在各个物种中都是通用的。
2.比如说这一条：“4、有关扩增引物设计的问题。在针对一段目的基因进行扩增前是不是先要了解它的具体结构和序列，找到两边的保守序列，根据保守序列来设计引物呢？以ITS2为例，它的两边为5.8s和28s基因，均为保守序列，我是不是要查出这两个基因的序列来才能进行引物设计呢？如果我想扩增的是一段不知道序列的基因，也不知道两边是不是有保守序列，这时该怎么设计引物呢？”直接使用ITS2引物TCC GTA GGT GAA CCT GCG G和GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC就好了，在你的物种里应该能扩出来
3.如果使用通用引物扩不出来考虑自己设计引物，一般使用同属或者同科植物的序列设计兼并引物，具体参见Primer Premier 5.0软件的说明。
4.这句话：”可是如果我想扩增的是一段不知道序列的基因，也不知道两边是不是有保守序列，这时该怎么设计引物呢？”不知你究竟想干什么，如果不是做条码的片段，又不知道序列。不可能设计引物
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4楼2013-05-29 09:50:10
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j134104

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xujingyuanxu: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-05-28 13:59:10
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 17:54:51
1.没问题。
2.可以。
3.不需要，引物特异性和通用性挺好的。
4.干嘛要设计引物，先用通用its2引物试试，基本没问题。自己设计流程就如你所述。
5.切胶回收就好了。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-05-26 08:28:22
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xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by j134104 at 2013-05-26 08:28:22
1.没问题。
2.可以。
3.不需要，引物特异性和通用性挺好的。
4.干嘛要设计引物，先用通用its2引物试试，基本没问题。自己设计流程就如你所述。
5.切胶回收就好了。
...

谢谢您的帮助。可是如果我想扩增的是一段不知道序列的基因，也不知道两边是不是有保守序列，这时该怎么设计引物呢？
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我努力，我坚持，我成功！
3楼2013-05-28 13:59:53
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xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by j134104 at 2013-05-29 09:50:10
我觉得你还是没说清楚。
1.如果你做的是植物条形码，直接使用条形码的引物就行了，ITS、rbcL、matK、psbA-trnH等序列的引物在各个物种中都是通用的。
2.比如说这一条：“4、有关扩增引物设计的问题。在针对一段目 ...

谢谢你的帮助
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5楼2013-05-29 15:16:23
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