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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[交流] PCR产物直接双酶切后电泳看不到条带

做完PCR后直接双酶切，然后跑电泳，但是看不到条带，这是什么原因啊？！是因为浓度不够？但是我PCR后跑电泳条带还是挺亮的
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1楼2013-03-23 08:55:22
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1949stone: MolEPI+1, 向你学习 2013-06-28 12:15:50
可能原因：
1.PCR的电泳的亮带可能是假阳性的非特异性扩增带，不放心就测序确认一下；
2.做酶切时的DNA浓度太低，所以需要用超滤离心浓缩一下看看；
3.PCR的电泳的亮带可能是特异性扩增带，但是从胶中回收目的DNA太少；
4.目的DNA酶切之间已经被降解；
5.酶切目的DNA的限制性内切酶失活，或受到抑制，换别的酶在尝试。
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30楼2013-06-28 02:54:37
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
酶切前取少量pcr产物跑电泳了吗？酶切后点样时确实看着样液沉在胶孔里而不是飘出来了吗？无图无真相。
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3楼2013-03-23 10:39:08
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
如果你PCR完后跑电泳很亮，直接双酶切怎么可能会没有条带？你该不会是点错了吧？双酶切后对条带大小也没有影响，repeat again
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4楼2013-03-23 11:21:40
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zzzaazzzzz

新虫 (初入文坛)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
是一直都这样，还是就这次刚做出现的，重复一下，这样的结果是不对的
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5楼2013-03-23 16:10:03
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 天使托 at 2013-03-23 11:21:40
如果你PCR完后跑电泳很亮，直接双酶切怎么可能会没有条带？你该不会是点错了吧？双酶切后对条带大小也没有影响，repeat again

不会点错啊，已经做了好几遍了，都是一样的结果啊
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7楼2013-03-23 16:33:33
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zzzaazzzzz at 2013-03-23 16:10:03
是一直都这样，还是就这次刚做出现的，重复一下，这样的结果是不对的

做了好几次了，之前也一直是看不到条带，按着我目的条带的大小直接切胶回收再继续往下做，有做出过结果，但是最近做不出来了
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8楼2013-03-23 16:34:35
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by XOooZzz at 2013-03-23 10:39:08
酶切前取少量pcr产物跑电泳了吗？酶切后点样时确实看着样液沉在胶孔里而不是飘出来了吗？无图无真相。

酶切前没跑电泳了，点样也没问题，我想知道的是一般PCR产物直接酶切的话要多大的量比较合适啊
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9楼2013-03-23 16:36:13
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天使托

专家顾问 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-03-23 16:33:33
不会点错啊，已经做了好几遍了，都是一样的结果啊...

当然也有可能是你酶切体系的缘故，体系中有可能DNA量太少了，给稀释了；也有可能是降解了.....
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10楼2013-03-23 17:04:25
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-03-23 16:36:13
酶切前没跑电泳了，点样也没问题，我想知道的是一般PCR产物直接酶切的话要多大的量比较合适啊...

把握比较大的时候可以不跑电泳。但一旦出问题你就找不到原因了。
所以实验还是做全套吧。PCR产物是回收后酶切还是直接在pcr反应液中酶切？回收后就几百到一千微克每20uL体系吧。
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11楼2013-03-23 19:32:09
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 天使托 at 2013-03-23 17:04:25
当然也有可能是你酶切体系的缘故，体系中有可能DNA量太少了，给稀释了；也有可能是降解了........

之前做别的目的片段的时候酶切后可以看到条带的，但是我回收PCR产物时是同时做了4管的PCR，4管的PCR产物一起回收的
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12楼2013-03-23 19:38:12
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by XOooZzz at 2013-03-23 19:32:09
把握比较大的时候可以不跑电泳。但一旦出问题你就找不到原因了。
所以实验还是做全套吧。PCR产物是回收后酶切还是直接在pcr反应液中酶切？回收后就几百到一千微克每20uL体系吧。...

是PCR产物回收以后再做的酶切，而且是4管PCR产物一起回收的，这样的话DNA含量应该不会很低吧
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13楼2013-03-23 19:39:37
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hesibonnie

新虫 (初入文坛)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
PCR产物不用回收，就可以直接酶切吗？
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15楼2013-03-23 22:57:10
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好想懂

银虫 (小有名气)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
跑的时间是不是太久了，跑出去了
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16楼2013-03-24 07:19:59
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 好想懂 at 2013-03-24 07:19:59
跑的时间是不是太久了，跑出去了

应该不会啊，Marker所有的条带都在胶上呢啊
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17楼2013-03-24 08:47:58
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by hesibonnie at 2013-03-23 22:57:10
PCR产物不用回收，就可以直接酶切吗？

回收了啊，回收以后再做酶切再回收然后连接
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18楼2013-03-24 08:48:34
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-03-23 19:39:37
是PCR产物回收以后再做的酶切，而且是4管PCR产物一起回收的，这样的话DNA含量应该不会很低吧...

所以说，最可能就是PCR根本就没有得到产物，然后就是回收的时候弄丢了。lz赶紧补两个电泳检测呀！
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20楼2013-03-24 13:59:29
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quxixing

金虫 (正式写手)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
有可能污染吗？或者搞个有图有真相！
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21楼2013-03-24 14:28:15
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主pcr以后是切胶回收的还是过柱回收的？如果是切胶回收的PCR产物亮度如何？如果是过柱回收的，做酶切之前最好跑胶确定下亮度等等，每一步都做好了，才能保证结果。好运
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22楼2013-03-24 18:47:21
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by XOooZzz at 2013-03-24 13:59:29
所以说，最可能就是PCR根本就没有得到产物，然后就是回收的时候弄丢了。lz赶紧补两个电泳检测呀！...

怎么检测啊？拿回收以后的PCR产物跑电泳吗？
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23楼2013-03-24 18:48:16
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by dhmdddd at 2013-03-24 18:47:21
楼主pcr以后是切胶回收的还是过柱回收的？如果是切胶回收的PCR产物亮度如何？如果是过柱回收的，做酶切之前最好跑胶确定下亮度等等，每一步都做好了，才能保证结果。好运

是切胶回收的，这是PCR产物电泳图，条带貌似不是特别亮而且还有非特异性条带

chuan.png
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24楼2013-03-24 18:53:24
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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23楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-03-24 18:48:16
怎么检测啊？拿回收以后的PCR产物跑电泳吗？...

PCR完毕，取2uL电泳，其余加入等体积0.5M氯化钠后氯仿异戊醇抽提蛋白，乙醇沉淀回收DNA。回收后，取2uL电泳，其余酶切。
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25楼2013-03-24 23:43:00
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shucanwei

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
DNA加多点，加到1ug，用浓点的胶跑
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26楼2013-03-25 00:47:11
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
24楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-03-24 18:53:24
是切胶回收的，这是PCR产物电泳图，条带貌似不是特别亮而且还有非特异性条带

chuan.png
...

是不是引物的特异性不够好?目的条带还好吧,应该可以回收到.你切胶回收的PCR产物酶切前重新跑胶验证,看条带是否单一,也看下亮度如何.
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27楼2013-03-25 20:04:18
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haitian0625

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以PCR产物电泳回收；若是没非特异，也可沉淀PCR产物再去酶切。
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28楼2013-03-25 21:54:54
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oliver501

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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10楼: Originally posted by 天使托 at 2013-03-23 17:04:25
当然也有可能是你酶切体系的缘故，体系中有可能DNA量太少了，给稀释了；也有可能是降解了........

那至少原条带应该会出现吧
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29楼2013-06-27 22:06:29
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fyz72322楼
2013-03-23 09:53   回复  
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haixiawu6楼
2013-03-23 16:16   回复  
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licong952714楼
2013-03-23 19:43   回复  
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yingying158819楼
2013-03-24 09:53   回复  
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ytflark31楼
2020-08-27 18:07   回复  
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