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whmxiaoyumi

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于定量PCR扩增效率的若干问题

我做定量PCR（qRT-PCR）一段时间了，由于模板少的情况基因表达量低，很多样本会出现扩增不出来的情况。每当CT值到32以上，得到的结果就各种不稳定，为此很是纠结。看了一下各路帖子，我大概总结了一下可能的办法如下：
   1.引物特异性反转录。在反转录时加入目标基因上游3’ 引物。对目的片段进行特异性的反转录。
   2.加入Mg2+。对于普通PCR中加入Mg2+，确实可以提高扩增效率。但是对于定量PCR，是否有同样的效果我不太清楚。另外，我用的是SYBR GREEN MASTER MIX，说明书指出buffer已经是优化好的，不建议再添加 Mg2+，说这样会降低扩增的特异性。
   3.QPCR三步扩增程序，以前一直是用的二步扩增即 95C 15S 60C 45S 。后来有建议用三步扩增 95C 15S 60C 20S 72C 30S，这个扩增程序我用过对于二聚体有比较明显的效果，对于特异性的效果似乎不明显。有同学说三步的扩增会提高扩增效率，不知道这一点有没有大神指点一下。
   4.最近听说Eva-green。有些人说Eva-green要比SYBR Green I要好，对PCR反应抑制小。不知道有没有用过的同学分享一下经验。在定量PCR时，是否能够明显降低结果CT值呢？
   5.takara cellamp 试剂盒，号称单细胞可以做PCR。我打电话去问了一下代理商，他们表示用的人不多。
  对于这些办法，我都不能百分百确定是否有效果，本应该自己去试的，不过还是想问问大家的意见。不知道各位大神对于上面的各项策略有没有具体的实验经验，或者有更好的解决办法。
  非常感谢！
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1楼 2013-03-15 16:42:05
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hy_sandra

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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科研是無止盡的
2楼2013-03-15 21:50:15
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