| 查看: 2594 | 回复: 1 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者whmxiaoyumi将赠送您 2 个金币 | ||
whmxiaoyumi新虫 (初入文坛)
|
[求助]
关于定量PCR扩增效率的若干问题
|
|
|
我做定量PCR（qRT-PCR）一段时间了，由于模板少的情况基因表达量低，很多样本会出现扩增不出来的情况。每当CT值到32以上，得到的结果就各种不稳定，为此很是纠结。看了一下各路帖子，我大概总结了一下可能的办法如下： 1.引物特异性反转录。在反转录时加入目标基因上游3’ 引物。对目的片段进行特异性的反转录。 2.加入Mg2+。对于普通PCR中加入Mg2+，确实可以提高扩增效率。但是对于定量PCR，是否有同样的效果我不太清楚。另外，我用的是SYBR GREEN MASTER MIX，说明书指出buffer已经是优化好的，不建议再添加 Mg2+，说这样会降低扩增的特异性。 3.QPCR三步扩增程序，以前一直是用的二步扩增即 95C 15S 60C 45S 。后来有建议用三步扩增 95C 15S 60C 20S 72C 30S，这个扩增程序我用过对于二聚体有比较明显的效果，对于特异性的效果似乎不明显。有同学说三步的扩增会提高扩增效率，不知道这一点有没有大神指点一下。 4.最近听说Eva-green。有些人说Eva-green要比SYBR Green I要好，对PCR反应抑制小。不知道有没有用过的同学分享一下经验。在定量PCR时，是否能够明显降低结果CT值呢？ 5.takara cellamp 试剂盒，号称单细胞可以做PCR。我打电话去问了一下代理商，他们表示用的人不多。 对于这些办法，我都不能百分百确定是否有效果，本应该自己去试的，不过还是想问问大家的意见。不知道各位大神对于上面的各项策略有没有具体的实验经验，或者有更好的解决办法。 非常感谢！ |
回复此楼» 猜你喜欢
球磨分散剂
已经有4人回复
-
阴阳离子交换剂！！！！
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有125人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酸接酚羟基，
已经有11人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酰氯
已经有10人回复
-
酸酐或者羧酸酰氯化
已经有15人回复
-
酚羟基接入磷酸，磷酸酯化
已经有26人回复
-
土壤中可溶性有机碳种类
已经有1人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- QPCR扩增效率太低
已经有20人回复
- QPCR之 扩增效率
已经有8人回复
- 荧光定量PCR扩增效率低
已经有16人回复
- 荧光定量PCR设计了三对引物了，都扩增不出来，郁闷啊
已经有4人回复
- 求高人指点qpcr问题，扩增效率太高！
已经有14人回复
- 相对定量中怎样提高扩增效率
已经有5人回复
- real-time PCR相对定量2 -△△CT法中用来判断扩增效率的标准曲线怎么制作？
已经有8人回复
- 荧光定量PCR结果如何处理
已经有12人回复
- 荧光定量pcr溶解曲线好几个峰，但是电泳只有一条目的条带，怎么回事
已经有5人回复
- 着急！RT-PCR扩增效率低，情况很诡异，求助高手帮忙指点
已经有12人回复
- 关于qPCR的几个问题，求解答
已经有3人回复
- 相对定量荧光PCR结果分析中的SD如何计算？
已经有7人回复
- Real-Time PCR加样过程中的那些细节
已经有19人回复
- 荧光定量PCR的扩增曲线很奇怪，什么原因
已经有7人回复
- 荧光定量PCR扩增效率怎么做？？？？我要被逼疯了
已经有17人回复
- 荧光定量扩增效率低怎么办
已经有3人回复
- 不解的问题，q-PCR结果分析。
已经有6人回复
- 关于real-time PCR温度优化的问题
已经有6人回复
- 实时定量PCR 数据处理
已经有7人回复
- 【求助/交流】荧光定量pcr出现直线扩增曲线，求指导
已经有5人回复
- 【求助/交流】实时荧光定量PCR的扩增效率低该如何改进？
已经有5人回复
- 【求助/交流】荧光定量pcr
已经有11人回复
- 实时定量PCR应用中的问题及优化方案
已经有20人回复
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
|
1.特�?性反轉錄定量需要的模板會比較多，而且擴增的效率?K沒比較好，反而略差。若同一樣本中，要測的基因不多，是可考慮，因為步驟少，誤差相對會少一些。 2.三步擴增的效率是高一些，因為tag酵素活性在70度~72度的活性是最佳的。60度只是堪用而已 3.除非要擴增的片段是GC rich，否則不太需要多加Mg，而且最好的qRT-PCT所需的片段通常都很小，因此也不需Mg 4.Eva-green我沒用過，倒是ABI有新的Power SYBR Green可用，較敏感，可提高Ct值 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
2楼2013-03-15 21:50:15
10