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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆片段不是目的片段
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康葱头

新虫 (正式写手)

[求助] 克隆片段不是目的片段

根据已有的全基因组序列，想克隆一个片段，设计引物，目的片段大小为2500bp，结果Ｐ出来的只有１５００－２０００ｂｐ。我就想先克隆测序看下，到底是怎么回事，会不会是片段太大，断了。结果测出来的结果为１７００ｂｐ左右大小，而且和原片段相似性只有３５%左右，但是在克隆测序的片段里又能找到我所设计的引物，这是怎么回事？请各位大侠指教！
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1楼 2013-02-01 22:39:39
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康葱头

新虫 (正式写手)
将测序得到的序列结果去ＮＣＢＩ里ＢＬＡＳＴ，只有３５ＢＰ的片段与一些序列有９７%的同源性，其它序列都搜不到相似性高的同源性序列，这是为什么？
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2楼2013-02-01 23:05:14
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物特异性决定扩增产物
说明引物设计的错误引发太高，特异性不好
重新设计引物就可以了
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3楼2013-02-01 23:11:44
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robustli

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
康葱头: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-02-02 17:41:29
I agree with the above. On one hand, your primer may be not specific. On the other hand, you may change your pcr condiction, the fragment you now got might caused by non-specific amplifying.
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immunologyparasite
4楼2013-02-02 10:42:24
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rola

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
康葱头: 金币+1 2013-02-02 17:41:18
片段断裂的可能性较低，多数是引物特异性不高，在模板的其他地方发生了错误结合。建议加长引物的碱基数以提高特异性。
测序1700bp的长度应该是两段测序拼接的结果，要去掉测序两头的不可信数据再进行比对，不过测序结果和PCR一样并不是百分百可靠。
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rola
5楼2013-02-02 10:51:29
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
康葱头: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-02-02 17:41:03
克隆基因属于多基因家族吗？既然有基因组全序列，引物设计后是否做了blast？
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6楼2013-02-02 12:06:34
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康葱头

新虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-02 12:06:34
克隆基因属于多基因家族吗？既然有基因组全序列，引物设计后是否做了blast？

没有，是一个基因的上游序列（启动子序列）；因为我不是做生物信息学的，我只会用小片段的比对，全基因组的blast没做
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7楼2013-02-02 17:40:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 康葱头 at 2013-02-02 17:40:19
没有，是一个基因的上游序列（启动子序列）；因为我不是做生物信息学的，我只会用小片段的比对，全基因组的blast没做...

引物设计好后最好做blast，保证引物特异性。你的情况可能是引物特异性不好，启动子序列往往需要被一些共同因子所识别，所以克隆时更需要注意引物的特异性。
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8楼2013-02-03 09:17:48
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