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飞飞050227

金虫 (小有名气)

[求助] western-blot求助,急急急!!求指点求建议!!!

做了两个月了,刚开始没一点信号后来好不容易有信号了可是整个泳道都亮,发帖有亲们说是上样量太大还有亲说2抗浓度太大,结果做了上样量梯度和抗体浓度梯度都没有什么改善,上图几张希望懂的亲们细心看完给予指点……7个不同的处理不要求目标条带,就看不同处理蛋白质表达量的不同,染过转膜后的胶基本没问题,第一张是每孔上35μL样品,二抗1:40,第二张是做的上样量梯度从左到右依次是30μL、25μL、20μL、15μL、10μL、5μL、2μL上样量最小的2个都没信号,10微升的又是没条带的地方也亮
第三张图是2抗浓度梯度左边是1:80,中间1:100,最右边1:200后边2个浓度干脆就没信号了……我实在是走投无路不知道该肿么办,封闭25°摇床一个小时一抗4°过夜,PBS/T洗4次每次15分钟,二抗25°一个半小时PBS/T洗4次每次15分钟……求指点!!

dell 2013-01-16



dell 2013-01-18 12 小时 08 分钟_Exposure_116.8sec.jpg



dell 2013-01-21 12 小时 56 分钟_Exposure_180.0sec.jpg
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生命不息,实验不止!
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飞飞050227

金虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-22 02:21:11
你的一抗就用盒子提供的,看一抗是什么来源,抗兔或者抗鼠什么的。二抗的作用是识别一抗的IgG, 所以二抗可以通用的。很多公司也有卖二抗的。多半盒子给的二抗不行,按照6楼的建议换一个二抗试试。...

一抗是Rabbit Anti-DNPAntibody
二抗是Goat Anti-Rabbit IgG
刚着手做WB都不懂……
生命不息,实验不止!
9楼2013-01-22 11:23:02
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查看全部 13 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
飞飞050227: 金币+1, 有帮助 2013-01-21 16:26:52
你用的是什么检测系统?二抗说明上有建议稀释倍数吧。我用的二抗是联HRP的,稀释倍数是1:20-50万倍。
2楼2013-01-21 15:49:04
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hxswdl

至尊木虫 (文坛精英)

Tortoise

文献杰出贡献

换个二抗试试

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
Dripping Concentrated!!energetic and active!
3楼2013-01-21 15:54:44
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飞飞050227

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by hxswdl at 2013-01-21 15:54:44
换个二抗试试

我的所有东西都是试剂盒带的……是按照试剂盒里的说明稀释的2抗
生命不息,实验不止!
4楼2013-01-21 16:22:57
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