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飞飞050227

金虫 (小有名气)

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[求助] western-blot求助，急急急！！求指点求建议！！！

做了两个月了，刚开始没一点信号后来好不容易有信号了可是整个泳道都亮，发帖有亲们说是上样量太大还有亲说2抗浓度太大，结果做了上样量梯度和抗体浓度梯度都没有什么改善，上图几张希望懂的亲们细心看完给予指点……7个不同的处理不要求目标条带，就看不同处理蛋白质表达量的不同，染过转膜后的胶基本没问题，第一张是每孔上35μL样品，二抗1：40，第二张是做的上样量梯度从左到右依次是30μL、25μL、20μL、15μL、10μL、5μL、2μL上样量最小的2个都没信号，10微升的又是没条带的地方也亮
第三张图是2抗浓度梯度左边是1:80，中间1:100，最右边1:200后边2个浓度干脆就没信号了……我实在是走投无路不知道该肿么办，封闭25°摇床一个小时一抗4°过夜，PBS/T洗4次每次15分钟，二抗25°一个半小时PBS/T洗4次每次15分钟……求指点！！

dell 2013-01-16

dell 2013-01-18 12 小时 08 分钟_Exposure_116.8sec.jpg

dell 2013-01-21 12 小时 56 分钟_Exposure_180.0sec.jpg

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生命不息，实验不止！

1楼 2013-01-21 15:32:00

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飞飞050227

金虫 (小有名气)

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引用回帖:

8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-22 02:21:11
你的一抗就用盒子提供的，看一抗是什么来源，抗兔或者抗鼠什么的。二抗的作用是识别一抗的IgG, 所以二抗可以通用的。很多公司也有卖二抗的。多半盒子给的二抗不行，按照6楼的建议换一个二抗试试。...

一抗是Rabbit Anti-DNPAntibody
二抗是Goat Anti-Rabbit IgG
刚着手做WB都不懂……