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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » western-blot求助，急急急！！求指点求建议！！！
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飞飞050227

金虫 (小有名气)

[求助] western-blot求助，急急急！！求指点求建议！！！

做了两个月了，刚开始没一点信号后来好不容易有信号了可是整个泳道都亮，发帖有亲们说是上样量太大还有亲说2抗浓度太大，结果做了上样量梯度和抗体浓度梯度都没有什么改善，上图几张希望懂的亲们细心看完给予指点……7个不同的处理不要求目标条带，就看不同处理蛋白质表达量的不同，染过转膜后的胶基本没问题，第一张是每孔上35μL样品，二抗1：40，第二张是做的上样量梯度从左到右依次是30μL、25μL、20μL、15μL、10μL、5μL、2μL上样量最小的2个都没信号，10微升的又是没条带的地方也亮
第三张图是2抗浓度梯度左边是1:80，中间1:100，最右边1:200后边2个浓度干脆就没信号了……我实在是走投无路不知道该肿么办，封闭25°摇床一个小时一抗4°过夜，PBS/T洗4次每次15分钟，二抗25°一个半小时PBS/T洗4次每次15分钟……求指点！！

dell 2013-01-16



dell 2013-01-18 12 小时 08 分钟_Exposure_116.8sec.jpg



dell 2013-01-21 12 小时 56 分钟_Exposure_180.0sec.jpg
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生命不息，实验不止！
1楼 2013-01-21 15:32:00
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hxswdl

至尊木虫 (文坛精英)

Tortoise

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
飞飞050227: 金币+1, ★有帮助 2013-01-21 19:44:03
引用回帖:
4楼: Originally posted by 飞飞050227 at 2013-01-21 16:22:57
我的所有东西都是试剂盒带的……是按照试剂盒里的说明稀释的2抗...

我们之前用生工的试剂盒，二抗浓度怎么换都是非常弱的带，几乎看不到，换了别的实验室的二抗，后面用传统的方法，结果马上就出来了
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Dripping Concentrated!!energetic and active！
6楼2013-01-21 19:08:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 飞飞050227 at 2013-01-22 11:23:02
一抗是Rabbit Anti-DNPAntibody
二抗是Goat Anti-Rabbit IgG
刚着手做WB都不懂……...

一抗是蛋白特异性抗体，二抗就是抗一抗免疫球蛋白的，所以只要是抗兔的二抗都可以用的。你可以自己从公司定，或者先问其他实验室要一点试试。
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10楼2013-01-22 11:39:49
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
飞飞050227: 金币+1, ★有帮助 2013-01-21 16:26:52
你用的是什么检测系统？二抗说明上有建议稀释倍数吧。我用的二抗是联HRP的，稀释倍数是1：20-50万倍。
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2楼2013-01-21 15:49:04
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hxswdl

至尊木虫 (文坛精英)

Tortoise

文献杰出贡献
换个二抗试试

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2013-01-21 15:54:44
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飞飞050227

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hxswdl at 2013-01-21 15:54:44
换个二抗试试

我的所有东西都是试剂盒带的……是按照试剂盒里的说明稀释的2抗
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生命不息，实验不止！
4楼2013-01-21 16:22:57
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飞飞050227

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-21 15:49:04
你用的是什么检测系统？二抗说明上有建议稀释倍数吧。我用的二抗是联HRP的，稀释倍数是1：20-50万倍。

我的是millipore的羰基化检测试剂盒，1抗2抗都是试剂盒里的，试剂盒说明书上建议的2抗稀释倍数是1:300但是我做的2抗浓度梯度200的时候就已经没信号了
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生命不息，实验不止！
5楼2013-01-21 16:24:33
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飞飞050227

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hxswdl at 2013-01-21 19:08:12
我们之前用生工的试剂盒，二抗浓度怎么换都是非常弱的带，几乎看不到，换了别的实验室的二抗，后面用传统的方法，结果马上就出来了...

你们做的什么？我做的羰基化修饰，别的实验室都没做这个的，找不来抗体……
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7楼2013-01-21 19:43:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
飞飞050227: 金币+2, ★有帮助 2013-01-22 11:23:10
引用回帖:
7楼: Originally posted by 飞飞050227 at 2013-01-21 19:43:41
你们做的什么？我做的羰基化修饰，别的实验室都没做这个的，找不来抗体……...

你的一抗就用盒子提供的，看一抗是什么来源，抗兔或者抗鼠什么的。二抗的作用是识别一抗的IgG, 所以二抗可以通用的。很多公司也有卖二抗的。多半盒子给的二抗不行，按照6楼的建议换一个二抗试试。
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8楼2013-01-22 02:21:11
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飞飞050227

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-22 02:21:11
你的一抗就用盒子提供的，看一抗是什么来源，抗兔或者抗鼠什么的。二抗的作用是识别一抗的IgG, 所以二抗可以通用的。很多公司也有卖二抗的。多半盒子给的二抗不行，按照6楼的建议换一个二抗试试。...

一抗是Rabbit Anti-DNPAntibody
二抗是Goat Anti-Rabbit IgG
刚着手做WB都不懂……
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9楼2013-01-22 11:23:02
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